DB12T 647-2016 大白菜品种纯度SSR分子标记检测方法.docx

ICS?67.050

B?31

DB12

天 津 市 地 方 标 准

DB12/T?647—2016

大白菜品种纯度?SSR?分子标记检测方法

Methods?of?identifying?varietal?purity?of?Chinese?cabbage?by?using?SSR-based?markers

2016-09-27?发布 2016-11-01?实施

天津市市场和质量监督管理委员会发布

DB12/T?647—2016

前 言

本标准按照?GB/T?1.1—2009?给出的规则起草。

本标准由天津市农村工作委员会提出。

本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心。

本标准主要起草人：赵新、王超楠、兰青阔、王成、刘莉莉、朱珠、李梅、陈锐、徐石勇。

本标准?2016?年?9?月首次发布。

I

DB12/T?647—2016

大白菜品种纯度?SSR?分子标记检测方法

1 范围

本标准规定了大白菜品种纯度SSR分子标记检测方法的术语和定义、检测方法、纯度计算方法。

本标准适用于大白菜单交种的纯度检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T?3543.2 农作物种子检验规程?扦样

GB/T?6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种纯度?varieties?purity

品种纯度指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占

检测样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。

3.2

聚合酶链式反应?polymerase?chain?reaction（PCR）

一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。

3.3

简单重复序列?simple?sequence?repeat（SSR）

由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串

联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

3.4

分子标记?molecular?marker

以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。

4 原理

SSR分布于大白菜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR

技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行大白菜品种纯度检测。

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5 仪器设备及试剂

5.1 仪器设备

PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000?V，400?mA，400?W）；万分之一电子天

平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌

锅；pH计等。

5.2 试剂

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基

硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青

FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；

过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；Taq?DNA聚合酶（含Mg2+的10×PCR缓冲液）；四

种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold?View染料；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T

6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。

5.3 溶液配制

相关溶液配制方法见附录A。

6 方法步骤

6.1 取样

按照GB/T?3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取10?g种子，分别随机取其亲本种子10粒。

6.2 单粒种子的?DNA?提取

6.2.1 样品预处理

在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花，用自来水浸湿后均匀地撒上种子，再于表面覆盖一

层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16小时35℃光照培养，8小时28℃暗培养，待种子长出子叶后

备用。也可采用经验证的、等效的培养条件。

6.2.2 DNA?提取

取单株幼苗子叶，放入1.5?mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5?mL离心管中。将DNA提取液预

热到65?℃，每管放入400?μL混合样品，将离心管置于65?℃金属浴或水浴锅中，保温30?min后取下，向

离心管中加入400?μL?24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10?000?g离心10?min。将上清液200?μL转入

另一支1.5?mL离心管，加入400?μL?-20?℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10?000?g离心1?min，