猪伪狂犬病毒gE抗体磁微粒化学发光检测方法.docxVIP

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猪伪狂犬病毒gE抗体磁微粒化学发光检测方法

1范围

本文件规定了猪伪狂犬病毒gE抗体磁微粒化学发光检测方法的规范性引用文件、试剂与耗材、仪器与设备、技术原理、操作步骤、结果计算及判定等内容。

本文件适用于猪血清中伪狂犬病毒gE抗体的检测，可用于猪伪狂犬病毒gE抗体的免疫筛查、辅助诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T18641伪狂犬病诊断方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4符号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AE:吖啶酯（AcridiniumEster）

CLIA:化学发光免疫分析法（ChemiluminescenceImmunoassay）

ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）Pr/AD:伪狂犬病（Pseudorabies，Pr；Aujeszky’sdisease,AD）PRV:伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus）

PPRV:猪伪狂犬病毒（PorcinePseudorabiesVirus）

5试剂与耗材

5.1磁微粒工作液

偶联链霉亲和素的磁性微粒。

5.220×浓缩洗液，按照附录A.1配置。

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5.3抗体工作液

吖啶酯标记的猪伪狂犬病毒gE单克隆抗体

5.4抗原工作液

生物素标记的猪伪狂犬病毒gE重组蛋白。

5.5校准品稀释液,按照附录A.2配置。

5.6PPRV-gE抗体工作校准品

包括工作校准品1、工作校准品2、工作校准品3、工作校准品4、工作校准品5、工作校准品6，抗体含量分别为3.125U、25U、100U、400U、1600U、6400U，按照附录B制备。

5.7PPRV-gE抗体产品校准品

包括产品校准品1和产品校准品2，抗体含量分别为100U和1600U，按照附录C.1制备。

5.8PPRV-gE抗体质控品

包括质控品1和质控品2，质控品1抗体含量≤50U，质控品2抗体含量范围为280U～520U，按照附录C.2制备。

5.9化学发光底物

6仪器与设备

6.1高速冷冻离心机（最大转速：15000rpm）

6.2全自动化学发光免疫分析仪

6.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱

6.4一次性采血器（5mL、10mL）

6.51.5mL无菌离心管

6.6专用样本架

6.7可调单道移液器（0.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL）

7技术原理

采用磁微粒化学发光--竞争法原理进行检测。首先将链霉亲和素磁珠、生物素标记的抗原、吖啶酯标记的抗体和待检血清混合孵育，发生特异性免疫反应；然后加入化学发光底物，读取发光值。通过检测吖啶酯标记的抗体工作校准品拟合校准曲线，通过产品校准品校准曲线，将待测样本代入校准曲线计算血清中的抗体含量，判定结果。发光强度与猪伪狂犬病毒gE抗体的含量成反比。

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8检测前准备

8.1样品采集及保存

样品采集按照NY/T541进行。使用一次性采血器静脉采血，不少于2mL，用自然析出法分离血清后，置于无菌血清管中，按照GB19489样品处理的生物安全措施、实验室生物安全通用要求处理样本，若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-20℃以下冷冻保存。

血清样本运输时应注意冷藏。

8.2样品处理

取8.1中的样品，8000rpm，离心2min，取上清放于1.5mL尖底离心管中，体积应大于300μL，待检；若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，应离心去除杂质，轻微操作，避免出现泡沫。

8.3溶液配制

洗涤液：将20×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水1:20倍稀释，装入洗涤液桶。无离子水或蒸馏水均应符合GB/T6682的要求。

8.4仪器准备

阅读全自动化学发光免疫分析仪说明书，放置反应杯，扫码放置底物、系统维护液，开始自检。

8.5试剂准备

将磁微粒工作液、抗原工作液、抗体工作