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牛羊冷冻精液重要垂直传播人畜共患病原的检测技术

1范围

本标准规定了动物布鲁氏菌病、结核病、Q热、衣原体四种疫病诊断所用的常规分离鉴定及qPCR检测方法的技术要求和操作规范。

本标准适用于牛、羊等动物精液中布鲁氏菌、结核分枝杆菌、Q热立克次体、流产衣原体的诊断及可疑样品的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。Bp：碱基对（basepair）

BHQ1：无荧光猝灭基团(Blackholequencher-1)

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold）dNTP：脱氧核糖核酸

DMSO：二甲基亚砜EDTA：乙二胺四乙酸

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein)PBS：磷酸盐缓冲液

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNAploymerase）

5仪器与设备

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5.1II级生物安全柜。

5.2荧光定量PCR扩增仪。

5.3精液采样器。

5.4高速台式冷冻离心机，可控温至4℃,离心速度可达12000g以上。

5.5微量移液器：量程为0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL和200μL~1000μL。

5.6涡旋震荡仪。

5.7无菌注射器或EP管。

5.8分析天平。

5.9冰箱：2℃~8℃、-20℃和-70℃以下。

5.10恒温水浴锅：0℃~100℃。

5.11组织研磨器或研钵。

5.12高压灭菌锅。

5.13电热恒温鼓风干燥箱：0℃~100℃。

6试剂与耗材

6.1除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682-2008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。

6.2引物和探针。采用无DNA、无RNA水将每条引物与探针（序列见表1）配制成100μmol/L储存液，置-20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。荧光定量PCR扩增仪。

6.3离心管。

6.4PCR光学反应管。

7原理

以种特异的基因组序列为模板；Q热立克次体qPCR以IS1111为模板；流产衣原体以OmpA基因为模板设计特异扩增引物与探针。

8精液样品采集与运输

8.1人工阴道采集精液

对公牛、公羊等大型动物可用一专门的人工阴道套在发情的雄性动物阴茎上，采集精液；或可将人工阴道置入雌性动物的阴道内，待动物交配完毕后，取出人工阴道采集精液；或将人工阴道固定在雌性动物外生殖器附近，雄性动物阴茎开始插入时，立即将其阴茎移入人工阴道内，射精完毕后，采集人工阴道内的精液。

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8.2其他阴道采集精液

将发情的雌性动物与雄性动物共处，当雄性动物被刺激发情后，立即将雄性动物分开，再用人工法刺激其射精。也可按摩雄性动物的生殖器或用电刺激其发情中枢或性敏感区，使其射精。

8.3精液的运输

采取的样品须在取样后24h内4℃冷藏送至实验室，附有标签或采样单，清楚标明采样时间、地点、数量、采集人、养殖数量及方式、临床症状、动物来源、养殖方式、养殖数量，采样数目、免疫状况、临床症状和采样时间、采样人等信息。此外采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作应遵守GB19489-2008的有关规定。

9qPCR方法

9.1精液前处理

将被检精液样品置于试管中，加入3倍~4倍量的15%~20%安福民溶液，充分摇匀后37℃作用1h，加1倍~2倍量的灭菌水，1000g离心20min~30min，弃上清液沉淀物加水恢复量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养。安福民（antiformin）沉淀浓缩法具体操作参见附录B.1。

9.2基因组DNA的提取

在上述已完成前处的样品（沉淀物）中加人50μL~100μLDNA提取液充分，56℃温浴30min，98℃~100℃加热10min瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，