基于等质量肽段末端标记策略的质谱鉴定新算法.docx

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基于等质量肽段末端标记策略的质谱鉴定新算法

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郑乃仁+单亦初+邓玉林+张玉奎

摘要等质量肽段末端标记（Isobaricpeptideterminilabeling，IPTL）是一种使用轻、重同位素分别对肽段的C端和N端进行等重标记的技术。在对使用这种标记技术得到的数据进行一级谱分析时，由于肽段的质量相同，不会增加样本的复杂性，而在处理二级谱的数据时，可利用成对的b、y离子进行分析。本研究利用IPTL方法得到的实验数据设计了一种新的打分算法：全部离子打分算法（Allionsscoringalgorithm，AISA）。AISA在对数据进行处理时，可以同时得到定性和定量信息。在QExactiveHeLa和HumanHCCHL数据集上的蛋白定量覆盖率分别达到99%和100%。在QExactiveHeLa2DRPLC数据集上，AISA算法鉴定到的PSM、唯一肽段和蛋白质分别比Morpheus高15%、26%和22%。在HumanHCCHL数据集上，AISA算法鉴定到的PSM、唯一肽段和蛋白质分别比Morpheus高24%、39%和27%。在QExactiveHeLa和HumanHCCHL数据集上蛋白质定量比值的平均值非常接近1，分别为1.18和0.90；在0.5～2.0区间内的定量比值分别为91%和94%。

1引言

与几乎处于静态的基因组不同，细胞的蛋白质组会随外部刺激及内部反应而持续变化[1，2]。使用基于稳定同位素稀释技术的相对定量方法，可以对蛋白质表达谱的变化进行研究[3，4]。通过对细胞间差异进行蛋白质表达及修饰层面上的定量描述，能为理解复杂的生物现象提供关键信息[5，6]。为引入不同质量数的稳定同位素至肽段的特定位点，可采用多种方式，最常见的是化学标记、酶解标记和代谢标记3种方法[7～10]。使用质谱检测轻、重稳定同位素标记的等量蛋白质，通过比较相应肽段的峰面积，即可对其进行相对定量研究[11]。

在采用鸟枪法（Shotgun）的蛋白质组学研究中，常使用数据依赖采集（Datadependentacquisition，DDA）模式来获取二级质谱数据。其基本策略为：选择一级谱中丰度最高的母离子进行二级碎裂，并将其加入临时排除名单，在一段时间内不再进行采集。如果共洗脱的母离子较多，将没有足够的时间对所有母离子进行二级碎裂，可检测的动态范围不可避免地受到限制，高丰度蛋白更容易被鉴定，而低丰度蛋白很难被鉴定。在常规的DDA模式鸟枪法蛋白质组学实验中，只有约16%会被选取进行二级碎裂[12]。

样本复杂性的增加是同位素标记方法的主要缺陷。通常，使用同位素标记的方法会使一级谱中峰的数量至少增加一倍，这也将进一步加剧对低丰度蛋白质母离子采样不足的缺陷，降低蛋白质定量分析的精确性。使用等质量标记策略可以克服这一缺陷[9，13，14]。因为对等质量标记实验的定量是在二级谱层面进行的，化学干扰影响降低，使其具有更高的信噪比。

等质量标记方法主要有相对与绝对定量等质量标签（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ）、串联质量标签（Tandemmasstags，TMT）、可裂解等质量标记亲和标签（Cleavableisobariclabeledaffinitytag，CILAT）、N，N二甲基化亮氨酸（N，NDimethylleucine，DiLeu）和等质量肽段末端标记（Isobaricpeptideterminilabeling，IPTL）等[15～20]。其中，iTRAQ、TMT、CILAT和DiLeu等都属于基于报告离子的定量方法，报告基团、平衡基团和反应基团组合在一起形成标记试剂。其中，报告基团和平衡基团有多种质量，但是它们的质量总和相等。因此，当标记试剂通过化学反应与肽段连接后，不同样品中相同蛋白质所对应的相同肽段的质量是相等的。但在进行二级谱分析时，报告基团会断裂下来。因此，根据质量不同的报告基团的丰度，就可以对不同样品中的蛋白质进行相对定量分析[21～24]。

IPTL方法采用蛋白内切酶LysC消化蛋白质，生成C端为赖氨酸的肽段；分别使用含有轻、重同位素的試剂对这些赖氨酸残基进行选择性修饰；进一步在N端使用含有轻、重同位素的试剂对肽段进行相反于C端的修饰，最终得到等质量的肽段混合物。同时对这些肽段进行质谱分析，在进行一级谱分析时，由于肽段的质量相同，不会增加样本的复杂性。然而在处理二级谱的数据时，则可利用成对的b、y离子进行分析[9]。在AISA算法中，同时有哪些信誉好的足球投注网站成对离子与非成对离子的信息；可以有