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一种检测围产期母羊胰岛素敏感的方法-葡萄糖钳夹技术

1范围

本文件规定了围产期母羊胰岛素敏感检测方法的试剂、仪器和设备、测定步骤。本文件适用于围产期母羊胰岛素敏感的检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

胰岛素敏感insulinsensitivity

指脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞对正常浓度的胰岛素产生反应不足的现象，亦即这些细胞需要更高的胰岛素浓度才能对胰岛素产生反应。

2.2

高胰岛素-正血糖钳夹技术hyperinsulinemiceuglycemicclamptest

一种金标准方法，即给予一定量的胰岛素后，将葡萄糖用某种速率滴注入血液，部分葡萄糖能被利用，但血糖水平可维持稳态。

3试剂

3.1牛源胰岛素（购自美国sigma公司）。

3.2牛血清白蛋白（BSA，购自美国sigma公司）。

3.3生理盐水。

3.4浓度为10%的葡萄糖注射液。

3.5浓度为50%的葡萄糖注射液。

3.6葡萄糖灌注液：10%糖盐溶液与50%的葡萄糖注射液按5:3的比例配制成25%（w/v)的葡萄糖灌注液。

3.7胰岛素灌注液：胰岛素的用量为120μg/h。调节注射泵的速度，使胰岛素灌注液以10mL/h的速度恒流灌注，灌注量为120μg/h。首先1mL无菌水中加入1mg胰岛素与0.01gBSA，并充分混合，随后，再加入50μL6N盐酸制备为冻存液。再次，取2.88mL冻存液加入含0.1%BSA的生理盐水稀

释至240mL，再用0.22μm的一次性抽滤瓶负压过滤除菌，配制成灌注液待用。

4仪器和设备

4.1恒流泵（上海沪西分析仪器厂，型号HL-2）。

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4.2注射泵（保定兰格恒流泵有限公司，型号W0109-1B）。

4.3快速测血糖仪（美国强生公司，强生稳步型）。

4.40.22μm的一次性负压抽滤瓶。

4.5输液管。

4.6一次性静脉留置针。

5测定步骤

5.1饲养管理

正式试验前一周对母羊进行适应性训练，在代谢笼中饲养，自由饮水，每隔两小时饲喂一次，为避

免采食量变化对机体血糖水平的影响，需要对动物定量限饲。

5.2安装静脉留置针

灌注前一天，动物的一侧颈静脉安装静脉留置针建立静脉输注通道，该通道连接三通管，一端连接注射胰岛素，一端连接葡萄糖输注泵，混合后输注静脉。同时，在动物的另一侧颈静脉安装留置针用于采集血样。

5.3胰岛素与葡萄糖的灌注

胰岛素的灌注使用注射泵调节，保证胰岛素灌注液以10mL/h的速度恒流灌注入颈静脉中。葡萄糖的灌注液使用恒流泵调节，灌注速率随机体血糖水平的变化调节，使机体血糖水平保持稳定。

5.4血样的采集

灌注前一天，分别于07:30、08:30、13:30、14:30、19:30和20:30六个时间点采集血样，用快速测血糖仪测定血糖浓度，确定基础血糖水平。

在灌注期，葡萄糖，胰岛素灌注后每隔10min测定一次血糖，并根据血糖浓度调节目标血糖水平，使其稳定在基础血糖水平。待血糖稳定后，每隔1h采一次血样测定血糖并留样。

钳夹结束时，首先停止泵入胰岛素，预防低血糖发生，然后逐渐减少葡萄糖输入速度。

5.5血样的处理

采集的血样中加入肝素钠抗凝，低速台式离心机3000rpm，离心15min，取血浆以分析胰岛素和血糖浓度。

5.6血样的测定指标与方法

动脉血浆胰岛素浓度采用放射性免疫法测定，按照附录A中的简要操作方法进行测定。血浆葡萄糖浓度使用全自动生化分析仪测定，按照附录B中的简要操作方法进行测定。

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附录A（资料性）

胰岛素浓度简要测定步骤

1试剂配制

1.1Ins.标准品：向各标准瓶中分别准确地加入1mL缓冲液溶解。溶解15min后摇匀方可使用。溶解后各标准浓度分别为5、10、20、40、80、160μIU/mL。

1.2125I-Ins.：用10mL缓冲液溶解。

1.3豚抗-Ins.抗体：每瓶抗体加10mL缓冲液溶解。

1.4驴抗豚免疫分离剂：加样前必须充分摇匀。

1.5Ins.质控血清：使用前每瓶准确加入0.5mL蒸馏水溶解。

2测定步骤

取圆底聚苯乙烯试管若干，用记号笔编号NSB、S0-S6和待测样品管等，然后用微量加样器按表A.1所示加样。加样前所有试剂（尤其是分离剂）包括待测样品均要摇匀，并且最好平衡到室温。

表A.1加样程序表单位：μl

试剂

总T

NSB管

“0”管

各标准管（S-S）

质控或样品管

缓冲液

Ins.标准品（S-S）

质控或样品I-Ins.Ins.抗体

驴抗