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常用的单克隆抗体检测方法--第1页
常用的单克隆抗体检测方法
通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,在杂交瘤制备完成
后,需要对抗体进行一个检测,本文介绍了几种常用的抗体
检测的方法(1)免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应
的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而
成的免疫学技术。由于它特异性强,灵敏度高,现已广泛用
于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液:碳酸盐
缓冲液:取0.2mol/LNa2CO38ml,0.2mol/LNaHCO317ml
混合,再加75ml蒸馏水,调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液(PH8.0,
0.02mol/L):取0.1mol/LTris100ml,0.1mol/LHCl58.4ml混
合,加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液(PH7.2的PBS):
KH2PO40.2g,KCl0.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,NaCl8.0g,
Tween-200.5ml,加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液:
牛血清白蛋白(BSA)0.1g,加洗涤液至100ml;或用洗涤
液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液(2mol/L
H2SO4):取蒸馏水178.3ml,滴加浓硫酸(98%)21.7ml。e、
底物缓冲液(PH5.0,磷酸盐-柠檬酸缓冲液):取0.2mol/L
Na2HPO425.7ml,0.1ml/L柠檬酸24.3ml,再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此
一次不宜配制过多。f、底物使用液:OPD底物使用液(测
490nm的OD值):OPD5mg,底物缓冲液10ml,3%H2O2
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常用的单克隆抗体检测方法--第1页
常用的单克隆抗体检测方法--第2页
0.15ml。TMBS或TMB底物使用液(测450nm的OD值):
TMBS或TMB(1mg/ml)1.0ml,底物缓冲液10ml,1%H2O2
25ul。ABTS底物使用液(测410nm的OD值):ABTS0.5mg,
底物缓冲液1ml,3%H2O22ul。g、抗体对照:以骨髓瘤细
胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清。h、
抗原:可溶性抗原:尽量纯化,以获得高特异性。病毒感
染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗
体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液:-20
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常用的单克隆抗体检测方法--第2页
常用的单克隆抗体检测方法--第3页
℃丙酮;或丙酮-甲醛固定液:Na2HPO4100mg,KH2PO4
500mg,蒸馏水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml;或丙酮-
甲醛溶液(1;1);或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板:40
孔、96孔、或条孔;硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅
读仪;或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②
可溶性抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)a、纯化抗原用包
被液稀释至1-20ug/ml。b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中,
置4℃过夜或37℃吸附2小时。c、弃去孔内的液体,同时用
洗涤液洗3次,每次3-5分钟,拍干。d、每孔加200ul封闭
液4℃过夜或37℃封闭2小时;该步骤对于一些抗原,可省
略。e、洗涤液洗3次;此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
f、每孔加50-1
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