常用的单克隆抗体检测方法.pdfVIP

常用的单克隆抗体检测方法--第1页

常用的单克隆抗体检测方法

通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成

后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体

检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应

的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而

成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用

于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐

缓冲液：取0.2mol/LNa2CO38ml，0.2mol/LNaHCO317ml

混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，

0.02mol/L）：取0.1mol/LTris100ml，0.1mol/LHCl58.4ml混

合，加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：

KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8.0g，

Tween-200.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：

牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤

液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L

H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、

底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L

Na2HPO425.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。

柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此

一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测

490nm的OD值）：OPD5mg，底物缓冲液10ml，3%H2O2

推荐精选

常用的单克隆抗体检测方法--第1页

常用的单克隆抗体检测方法--第2页

0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：

TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1%H2O2

25ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS0.5mg，

底物缓冲液1ml，3%H2O22ul。g、抗体对照：以骨髓瘤细

胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、

抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感

染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗

体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液：-20

推荐精选

常用的单克隆抗体检测方法--第2页

常用的单克隆抗体检测方法--第3页

℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg，KH2PO4

500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-

甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40

孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅

读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②

可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包

被液稀释至1-20ug/ml。b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，

置4℃过夜或37℃吸附2小时。c、弃去孔内的液体，同时用

洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。d、每孔加200ul封闭

液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省

略。e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。

f、每孔加50-1