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免疫球蛋白分离纯化含义以抗原免疫动物来制备抗血清是一个非常复杂混合物,包含血清全部成份。不过同抗原特异性结合抗体则主要是血清中免疫球蛋白组分。通常见于制备酶标抗体或荧光抗体免疫球蛋白必须高度纯化并含有特异性,不应含有非抗体血清蛋白。所以,为了浓缩和提升抗体效价,或为制备免疫球蛋白特异性抗体时,通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。抗体的精制专题知识讲座第2页

γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白主要成份,约占全部免疫球蛋白75％,所以,抗体分离纯化主要是分离纯化IgG。免疫球蛋白主要成份抗体的精制专题知识讲座第3页

对免疫球蛋白分离纯化有两方面含义:一是从理化性质上提取均质免疫球蛋白个别，去除杂质蛋白、提升免疫球蛋白含量。二是从免疫学角度上提取对某种特定抗原特异性抗体，这种特异性抗体能够是几类免疫球蛋白(IgG，IgM，IgE)混合物。免疫球蛋白分离纯化含义抗体的精制专题知识讲座第4页

抗体分离纯化方法在血清中抗体活性是相对稳定,所以要依据试验要求,降低无须要纯化过程,确保抗体活性和防止抗体绝对量损失。中性盐沉淀法是抗体分离和纯化首选方法,但利用盐析法提取免疫球蛋白,不能得到纯净免疫球蛋白。欲取得较纯净产品,还需要结合其它方法,如凝胶过滤、离子交换、亲和层析、区带电泳等进行深入分离纯化。抗体的精制专题知识讲座第5页

盐析法(中性盐沉淀法)????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????抗体的精制专题知识讲座第6页

盐析原理溶液中高浓度中性盐离子有很强水化能力,会夺取蛋白质分子水化层,使蛋白质胶粒失水,发生凝集而沉淀析出。不一样蛋白质在同一浓度盐溶液中溶解度不一样,可利用不一样浓度盐溶液使每个蛋白质成份分别析出,通常称为蛋白质盐析。抗体的精制专题知识讲座第7页

免疫球蛋白盐析条件许多中性盐都能使蛋白质盐析,如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠和磷酸盐等。最常见为硫酸铵,因它含有溶解度高且受温度影响较小优点,在室温或冰箱(4℃)内均可进行。普通认为在pH7.0时,50％硫酸铵饱和度可将全部免疫球蛋白都沉淀出来。33％饱和度时,大个别IgG可沉淀出来。40％饱和度时,沉淀物得率最高,但含IgM,IgA等β球蛋白个别增多。抗体的精制专题知识讲座第8页

注意事项温度:抗体对温度比较敏感，长时间暴露在室温能够使抗体失活，所以提取免疫球蛋白最好在2-4℃条件下进行。等电点:蛋白质在等电点时溶解度最低，兔IgG等电点为pI8.0，操作时应该避开使用等电点附近缓冲溶液。蛋白质浓度:蛋白质浓度过高时，会出现欲分离蛋白与其它蛋白质一起共沉现象所以蛋白质浓度应在2.5-3%为宜。浓度过高时应用PBS稀释。抗体的精制专题知识讲座第9页

离子交换法?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????抗体的精制专题知识讲座第10页

离子交换原理同等电聚焦电泳一样,离子交换剂以本身所带相反电荷与蛋白质净电荷相结合,蛋白质进入离子交换柱后,与离子交换树脂无亲和力蛋白质被洗脱下来。余下蛋白质均结合在树脂上,因为其蛋白质表面电荷性质不一样,与树脂亲和力也各不相同。利用不一样强度离子溶液,将其分别洗脱下来到达分离、纯化蛋白质目标。抗体的精制专题知识讲座第11页

阴阳离子交换标准离子交换剂由大量带电荷侧链,和不溶性树脂结合而成。DEAE等阴离子交换树脂侧链电荷为正。CM等阳离子交换树脂侧链电荷为负。若蛋白质所带净电荷为负,则需用阴离子交换树脂进行纯化,反之则使用阳离子交换树脂。抗体的精制专题知识讲座第12页

免疫球蛋白离子交换采取DEAE-纤维素反抗体进行精制,尤其是经过初步纯化后Ig纯化,效果尤为显著。IgG等电点为pI=8.0,IgM,IgA等电点为pI7.0,7.4,在pH8.0时IgG带正电荷,不能被DEAE-纤维素吸附而被洗脱下来。被DEAE-纤维素吸附其它球蛋白,可用逐步增加洗脱液中离子浓度方法将其逐一洗脱,或降低pH使之洗脱出来。抗体的精制专题知识讲座第13页

利用DEAE-cellulose52离子交换层析分离抗体DEAE-cellulose