探究实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定-教学课件.pptxVIP

探究·实践DNA片段的

扩增及电泳鉴定

-一、实验原理

二、材料用具

三、实验步骤

四、注意事项

五、结果分析

一、实验原理

(一)PCR扩增DNA片段的原理：

1.PCR利用了热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解旋和结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。

2.PCR扩增DNA片段还利用了半保留复制的原理。

5’-3’高温5’-3’

3’-5’变性

3’-5’

低

温

-3’-5’

-5’

复

性

Ⅲ

-3’

-5’

-3’-5’

5’

5’3’

延伸

中温

5’

3’

5’3’

1.分离：DNA分子具有可解离基团，在一定的pH下，这些

基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。

2.鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外光下被检测出来。

3.纯化：电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后

的克隆操作。ab

一、实验原理

(二)DNA片段电泳鉴定的原理：

1.凝胶浓度：琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。

凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。

2.DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。

电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。

3.DNA的构象：迁移速率：双螺旋环状DNA双螺旋链状

DNA单链DNA。

一、实验原理

(三)影响DNA迁移速率的因素：

大分子迁移速率低

小分子迁移速率高

一大小不同的DNA分子

凝胶孔隙

不同大小的DNA分子在凝胶中电泳示意图

加样孔

电泳

二、材料与用具

(一)用具：

1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)

2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)

3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)

4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头)5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)

TagDNA聚合酶一 引物一4种脱氧核苷酸— DNA模板一

PCR扩增仪

1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)

2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)

3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)

4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头)5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)

二、材料与用具

(一)用具：

1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)

2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)

3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)

4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头)5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)

二、材料与用具

(一)用具：

10倍浓缩的扩增缓冲液(含Mg²+)

5μL

20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液(实为dNTP)

1μL

20μmol/L的引物I

2.5μL

20μmol/L的引物Ⅱ

2.5μL

H₂O

2833μL

1-5U/μL的TaqDNA聚合酶(即耐高温的DNA聚合酶)

1—2U

模板DNA(用量为1pg-1μg)

5—10μL

总体积

50μL

二、材料用具

(二)试剂：

1.4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。

PCR反应体系的配方

(二)试剂：

2.电泳缓冲液(TAE或TBE)、凝胶载样缓冲液(内含指示剂一—溴酚蓝)、琼脂糖和核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)等。

EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物在紫外线激发下，发射出红橙色荧光。EB-DNA复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据