人类细胞质RNA提取RTPCR的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用分析课件.pptVIP

RNA2024/3/5星期二

主要内容◆人类细胞质RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用2024/3/5星期二

人类细胞质RNA提取

提取总RNA电泳合成cDNA第一链PCR2024/3/5星期二

真核细胞RNA的种类真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3端均有一多聚A(PolyA)尾巴。2024/3/5星期二

实验前的准备RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。2024/3/5星期二

常用的RNA酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失活，有高致癌性。（实验准备阶段使用）2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）2024/3/5星期二

实验原理Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。2024/3/5星期二

提取RNA（一）、准备试剂?氯仿?异丙醇?75℅乙醇?无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)2024/3/5星期二

提取RNA（二）、操作步骤取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（4000rpm5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清沉淀中加入1mlTRIzol，旋涡震荡10s重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5mlEP管，15~30℃放置5min加入0.2ml氯仿，用手摇晃15s，15~30℃放置5min12000rpm离心15min2024/3/5星期二

提取RNA（二）、操作步骤小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，加入等体积的异丙醇，15~30℃放置10min12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml70%乙醇，震荡数秒，8000rpm离心5min小心去上清，室温干燥5min，加入10ulDEPC水，打匀55℃水浴10分钟助溶2024/3/5星期二

提取RNA（三）、注意事项1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。4、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。2024/3/5星期二

提取RNA（三）、注意事项6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。7、防止RNA酶污染（1）RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等（2）严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。（3）最大限度地抑制内源性的RNA酶；而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。2024/3/5星期二

RNA保存溶解在无RNase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟，70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。2024/3/5星期二

RT-PCR的原理、方法

实验原理1、单拷贝基因表达存在逐步放大机制。2、PCR技术，即聚合酶链式反应。反应分三步：变性，退火，延伸。3、逆转录酶。可以以RNA为模板合成cDNA第一条链，或者以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。doesmatter可见，RT-PCR是一种将