真核生物DNA复制和起始调控分析解析.pptVIP

在DNA复制起始过程中，由6个亚基组成的复制起点识别复合体（originrecogniyioncomplex,ORC）首先识别并结合到复制起始点上。随后，一系列参与与DNA复制起始的蛋白质如Cdc6.Cdt1、MCM复合体等被依次召集到复制起始位点上，形成前DNA复制复合体（pre-ReplicationComplex,pre-RC）。Pre-RC复合体的组装及其去组装是DNA复制起始点上组装完成及表明该DNA复制起点被发行了执照从而能够起始DNA复制。二、前DNA复制复合体的组装过程三、DNA复制起始点识别复合体的构成和组装ORC：由六个蛋白（或亚基）构成，分别为Orc1、Orc2、Orc3、Orc4.Orc5和Orc6。Orc蛋白在结构和功能上均相当保守。经分析表明，芽殖酵母的ORC仅分布在有限的DNA复制起始位点上。与启动子相关的转录调节因子，可能影响ORC与DNA复制起始位点结合，进而影响DNA复制的起始。ATP的结合与水解也显著影响ORC的功能。在整个细胞周期中,ORC蛋白成员并不是一直以一个复合体的形式存在。ORC对DNA复制起始点的选择缺乏特异性,任何DNA系列都可以作为DNA复制起始点。四、Cdc6蛋白与前DNA复制复合体组装Cdc6(celldivisioncycle6)是参与DNA复制起始过程中的另一个重要蛋白。芽殖酵母Ccd6最早被鉴定出参与DNA复制起始调控。此后,在人、爪蟾、小鼠等相继发现Cdc6,他们在进化过程中显示出高度的序列保守性。Cdc6属于ATP酶家族——AAA+(ATPasesassociatedwithavarietyofcellularactivities),能够结合且水解ATP。Cdc6的含量在酵母细胞中呈现周期性变化,在G1期晚期开始表达,在G1/S期交界处到达高峰,进入S期后迅速降低,在下一轮G1期的晚期再次升高。芽殖酵母Cdc6与复制起始点上的ORC蛋白直接结合,并参与调控MCM蛋白结合到染色质。细胞进入S期是,即一旦DNA复制开始启动,芽殖酵母Cdc6发生磷酸化,经SCFCDC4（Skp1-CDC53-F-boxprotein）依赖性泛素化蛋白降解途径经蛋白酶降解。在酵母中,Cdc6在S期的降解有效的阻止同一个周期内MCM蛋白在复制起始点上的重新组装,从而阻止DNA在同一个周期内发生多重复制。在酵母细胞中,调节Cdc6的表达水平是保证“在一个细胞周期中DNA只能复制一次”的重要机制之一。五、Cdt1蛋白与前DNA复制复合体组装Cdt1也是参与DNA复制起始调控的重要蛋白之一。Cdt1（Cdc10dependenttranscript1）的、是1994年于酵母中首先发现的Cdc10依赖性转录因子。六、Mcm2-7复合体与前DNA复制复合体组装MCM蛋白在DNA复制起始过程中起主要作用。第三节前DNA复制复合体组装过程的调节前DNA复制复合体组装过程的调节机制主要是由周期性依赖性的CDK激酶活性进行直接或间接驱动的。Cdk（cyclindependentkinase）激酶活性在真核生物DNA复制起始调控中具有双重作用。一方面,当细胞进入S期,Cdk激酶活性增高,激活DNA复制的起始；另一方面,Cdk激酶活性阻止同一周期中S、G2和M期中DNA的多重复制。此外,Cdk激酶还控制特定起始点复制的起始时间。一、Cdk激酶对Orc蛋白的功能调节芽殖酵母细胞中的Orc2和Orc6遗迹裂殖酵母细胞中的Orc2等均可被Cdk激酶磷酸化。实验证明,只是磷酸化程度降低或丧失的突变体在特殊情况下还可能引起基因组再复制,说明Cdk通过磷酸化Orc蛋白,对DNA复制的起始进行负调控。二、Cdk激酶对Cdc6的功能调节当DNA复制起始完成,细胞进入S期,周期蛋白B/Cdk激酶表现活性,Cdc6就不再参与与前DNA复制复合体的组装。芽殖酵母Cdc6（或者裂殖酵母Cdc18）被CDK磷酸化后降解。Cdk激酶对MCM蛋白的功能调节在芽殖酵母中,Cdk激酶活性调节MCM的亚细胞定位。MCM蛋白于G1和S期中定位在细胞核中,而在G2和M期则从细胞核中被运送出核。Cdk激酶活性丧失将导致MCM滞留于细胞核。其次,MCM蛋白的磷酸化修饰还可能直接抑制MCM复合体解旋酶活性。四、Cdk激酶和Geminin对Cdt1作用的功能调节Cdk激酶磷酸化后降解从而下调Cdt1活性。Cdt1的抑制蛋白Geminin通过抑制Cdt1活性从而抑制执照系统Cdt1分子结构及与Geminin前端形成复合体示意图染色质构型对DNA复制起始的影响参