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重组蛋白质的分离纯化

摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约

占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉

淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其

应用研究提供理论依据。

关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体

随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程

中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离

纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关

键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。

纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定

了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除

杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的

表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组

蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。

与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的

大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前

主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。

重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降

解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90年代以来,国内外许多科学

工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提

高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10年来重组蛋白

分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。

1沉淀分离技术

1.1盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水

化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同

浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备，操作简单、

安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。

1.2有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活

度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，

溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。其特点是：

选择性高；其次，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。但是有机沉

淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。

1.3等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的pH值，使两性电解质在溶液pH值处于等电

点时，分子表面净电为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，

两性电解质的溶解度下降，从而沉淀析出。

1.4变性沉淀法利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择

性地使一种组分发生变性形成沉淀，而另一些组分保持不变，从而达到分离、除杂和提纯的

目的。此方法包括：热变性沉淀分离；酸碱变性沉淀分离；利用表面活性剂或有机溶剂引起

变性沉淀分离；利用酶进行变性分离。

2液液萃取技术

液液萃取技术是常用分离技术之一，在生物化工中也有广泛的应用。然而，大部分生物

物质是有生物活性的，需要在低温或室温条件下进行分离纯化，而采用传统萃取技术无法完

成。

双水相萃取技术是近年来发展很快的一种生物分离方法，与传统的液液分离方法相比，

双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势：蛋白质在其中不易变性；分相时间短，一般

只需5～15min；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对

蛋白质的结构有稳定和保护作用等[3]。近年来一些学者将双水相萃取技术与膜分离技术结

合起来，较好地解决了生物大分子在两相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。还有

一些学者利用亲和反应的高度专一性，在萃取剂上接上一定的亲和配基，使得双水相萃取体

系不仅具有处理量大的特点，而且具有专一性，提高了萃取效率。

液液反胶团(ReversedMicelles,RM)体系萃取技术是90年代以来发展较快的另一种