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【专题讨论】超详细包涵体复性常见问题分析

包涵体复性常见问题分析

1.对于尿素和盐酸胍该怎么选择?

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包

涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-

8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作

用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进

行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复

性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱

法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质

的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除

去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

2.怎样洗涤包涵体？

通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸

胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀

释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合

适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀

的方法，比通常的直接洗脱效果好。

3.8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

在4度放置半个月，都没什么问题。在室温放置超过48小时，

可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰

基化，所以早些处理BI溶液比较好。

4.包涵体复性有什么原则？

低浓度，平缓梯度，低温。

5.复性时的蛋白浓度是？

一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，

太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

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6.复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液

浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个

PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极

低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。

若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；

另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可

加适量甘油。

包涵体复性效率和检测

复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，

还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如

牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%

以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，

很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效

率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的

起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂

和其他添加剂的存在与否等。根据具体的蛋白性质和需要，可以从生

化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。其效果检

测方法如下：

1.凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测

变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫

键的蛋白复性后二硫键