重组DNA导入宿主细胞PPT课件.pptx

重组DNA导入宿主细胞;一、目的基因的获得;目的基因的克隆策略

从生物材料中分离特异的蛋白质，测定其氨基酸序列，推测其核苷酸序列。人工设计一段寡核苷酸探针从文库中筛选目的基因；或根据核苷酸序列设计引物，利用PCR方法扩增目的基因（蛋白质水平）。

利用逆转录酶将mRNA逆转录成cDNA，然后利用相应技术分离时空特异表达的基因或基因片段，并用这些基因片段作探针从文库中筛选目的基因（mRNA水平）。

构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆（鸟枪克隆）；

利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。

采用转座子标签法筛选文库获得目的基因

在已知基因的核苷酸序列情况下，利用设计引物，利用PCR方法扩增目的基因;获得目的基因后的用途

确定其表达调控机制和生物学功能，如详细分析其结构、功能及调控。与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。

研究生物种系进化与相关同源性。

建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。

将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状。在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。

;目的基因的分离方法

根据不同类型基因组的大小、基因组成和基因排列方式不同，采用以下的方法可以把目的基因从基因组中分离出来。

直接分离法

化学合成法

聚合酶链式反应（PCR）分离法

基于基因文库的分离法

;直接分离法

（1）限制性核酸内切酶酶切分离法

对已知序列的DNA分子；

对已知的定位目的基因；

其它DNA分子可与基因组文库相结合；

缺点：该方法适于从基因组简单的生物体中分离目的基因，如病毒等

（2）物理化学法

根据基因片段的碱基组成差异较大，其理化???质，如浮力密度和解链温度等的差异，从生物基因组中分离目的基因。

密度梯度离心法

单链酶解法

分子杂交法

;密度梯度离心法：其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度较高，而富含AT的DNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速离心技术可以分离GC含量较高的目的基因片段。

;单链酶解法

;化学合成法

化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。

从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的;基于PCR的分离法

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序

PCR法定向扩增目的基因的基本原理

使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。;直接从基因组中扩增

提取基因组DNA作模板

根据目的基因序列设计引物

PCR扩增（高温变性，使双链DNA解链，低温退火，使引物与DNA连接，在充足的dNTPs供应下，经30-35次循环，扩增几百万倍）

适合扩增原核生物基因。

真核生物基因组含有内含子！;从mRNA中扩增:RT-PCR

提取基因组totalRNA

反转录合成总cDNA作模板

根据目的基因序列设计引物

PCR扩增

适合扩增真核生物基因。

原核生物不易得到mRNA（？），也不含有polyA尾。;基于基因文库的分离法

大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。

核酸杂交法原理：

将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。

;14;应用表达文库（蛋白质表达文库）分离克隆的目的基因

筛选的方法：

1）利用抗体筛选表达文库；