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G418筛选稳定表达细胞系经验总结

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有

自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，

大家补充。

筛选之前确定G418浓度：

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的

G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约

为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和

蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对

细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表

达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生

素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张

转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜

超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418

的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在

100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14

天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。6个

细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到一个具体试

验：3x1024孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%

汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察

1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事

实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度

1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所

以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢

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负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹

没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加

G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每

3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至

200ug/ml。

2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是

否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就

可以用维持浓度，一般是筛选浓度的。1/2．

.

关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高

其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，

可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就

跟着高表达。

筛选时的培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥

无几。这时会出现两个问题：

1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo