人肌腱干细胞的分离与鉴定.docx

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人肌腱干细胞的分离与鉴定

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间充质干细胞是一种中胚层来源、具有高度多向分化潜能的成体干细胞，分布于全身结缔组织及器官间质，在特定的条件下可分化为脂肪细胞、神经细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌腱细胞和肌细胞[1]。最早发现从骨髓中提取出间充质干细胞，除此之外，学者们还从脂肪、脐带、牙髓、滑膜以及骨骼肌等组织中分离得到间充质干细胞[2]。

传统的观点认为，肌腱细胞是唯一存在于肌腱组织中的细胞类型。然而，很多肌腱组织的标本中出现骨样组织，暗示了其中可能存在一种多向潜能细胞，在某些条件下能发生成骨分化。肌腱干细胞的发现是这一猜测的有力验证。这种细胞首先由Bi等命名为肌腱干细胞[3]，随后学者们也从小鼠、人和兔子肌腱组织中提取出类似的细胞[4]。

肌腱干细胞兼备肌腱细胞和干细胞的某些性质，亦有差异。肌腱细胞、肌腱干细胞均属于特异性成熟细胞，前者已失去多向分化的潜能，以及不能表达干细胞标志物。由于容易取材和分离的优势，间充质干细胞已经作为种子细胞，广泛应用于组织工程中[5]。但Tan等[6]的研究表明，肌腱干细胞比骨髓间充质干细胞有着更好的克隆能力、更快的增殖速率、更高的表达肌腱相关基因，可能在成骨等多向分化方面更有优势。肌腱干细胞本身来源于肌腱组织，它的研究有利于理解肌腱炎、肌腱钙化以及腱骨愈合等人类肌腱组织相关疾病，有利于肌腱修复寻找合适的种子细胞。

1材料与方法

1.1主要试剂

0.25%胰蛋白酶、I型胶原酶、Lg-DMEM培养基、澳洲胎牛血清FBS、青霉素-链霉素双抗等。

1.2细胞分离与培养

本实验已通过广东药科大学附属第一医院伦理委员会的同意，遵循医学伦理标准。采用胶原酶消化法联合低密度接种法提取肌腱干细胞。肌腱干细胞的提取方法为：取自肌腱重建手术后剩余的肌腱组织块，去除肌肉、筋膜、腱鞘等组织，留取腱性组织。首先用0.25%胰蛋白酶预消化，然后用含胎牛血清的低糖培养基加入其中终止消化，剪碎肌腱，用Ⅰ型胶原酶消化。接着过滤、离心及计数细胞，采用Lg-DMEM完全培养基接种、培养及传代。

1.3肌腱干细胞的鉴定

1.3.1细胞克隆形成能力观察

将原代细胞以50、100、200个/平方厘米接种于6孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养，7天后行结晶紫染色，计算直径1毫米的克隆数。正置显微镜观察克隆形态。

1.3.2干细胞表面标志物检测

将5×105个第6代细胞于1μgPE或FITC标记的CD29、CD90、CD45、CD44抗体中室温孵育45分钟，PBS洗1次，12000g离心5分钟，重悬于300μL预冷的PBS中，荧光激活分选分析。采用流式细胞仪程序计算阳性表达细胞百分率。PE或FITC标记同型匹配的IgG1作为阴性对照。

1.3.3多向分化能力鉴定

将第2代的细胞悬液以5000个/平方厘米的密度接种6孔板中，待细胞完全融合后，加入成骨或者成脂诱导液诱导培养，每3天换一次诱导液，完全培养基培养的细胞作为对照组。14天后，4%多聚甲醛固定，成骨诱导行茜素红S染色，成脂诱导行油红O染色。

2结果

2.1形态的观察

接种2小时后观察到细胞开始贴壁，1天后可见细胞呈现梭形，大小大致均一，为间充质干细胞典型的形态。在1周左右细胞逐渐增多。传代培养后可呈旋涡状生长的细胞；当细胞融合率较高时，呈鹅卵石样排列。

2.2克隆形成能力的观察

培养3周后，结晶紫染色后，计数形成的克隆，克隆形成的标准为直径＞2毫米均。观察的结果是，0.8%-1.2%的细胞出现形成克隆。

2.3干细胞表面标志物的检测

为判断分离培养的细胞是否具有干细胞特性，采用流式细胞仪检测细胞表面标记物表达率。干细胞表面标记物CD105、CD44的阳性表达细胞百分率为超过99%和92%，造血系统表面标志物CD14、CD45的阳性表达细胞百分率只有0.10%和0.25%。

2.4多向分化能力的观察

成骨诱导3天即出现钙盐沉积，2周后可见多个钙盐结节形成。成脂诱导1周后，观察到细胞胞浆内出现细小脂滴，相互融合并逐渐增大，诱导2周可观察到脂滴形成，3周后经油红O染色可观察到细胞内的橘红色的脂肪滴。

3讨论

本实验成功地从人的肌腱组织中提取出一群特殊细胞，这些细胞具备干细胞特性，包括干细胞的克隆能力、阳性表达干细胞表面标志物以及具有多向分化的潜能。

肌腱干细胞是一种成熟的干细胞，在一定条件或者干预下可分化为肌腱细胞和非肌腱干细胞，后者包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。与肌腱细胞比较，肌腱干细胞在形态、增殖潜力和干细胞特异性方面均不同。它形态呈鹅卵石状，有较大的细胞核[7]。国际细胞治疗协会在2006年就提出了人类间充质干细胞的定义与标准。在这些标准中，95%以上的分离细