酶工程酶的分离纯化.ppt

2、亲和电泳——将亲和配体共价偶联于电泳凝胶上，由于亲和作用，待分离的酶与配体结合后，在电泳中不再移动，而其它杂蛋白不与配体结合，使目的酶分离出来。第127页,共132页，星期六，2024年，5月五、根据稳定性的差异建立的分

离纯化方法

—1、热变性法

—2、酸碱变性法

—3、表面变性法第128页,共132页，星期六，2024年，5月1、热变性法

——根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。第129页,共132页，星期六，2024年，5月2、酸碱变性法

——与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。

第130页,共132页，星期六，2024年，5月3、表面变性法

——可将酶溶液与惰性液体混合，振荡造成表面变性；如在酶液中加入氯仿，振荡后通常可分为3层：上面为未变性的酶，中层为乳浊状的变性蛋白，下层为氯仿。第131页,共132页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第132页,共132页，星期六，2024年，5月**Aftertheanimationiscomplete,aquestionisposed,similartotheoneintheLabmanual.Thestudentsneedtorealizethatsincethetubesmarchedinfromthelefttheearliestfractionscameofffirst.Theleftmostpeakiscorrect.Feedbackwillindicatethat.Jim?Whatdirectionshouldwehavethetubesmarchin.“Itwillprobablytakeabout10tubesbeforeourproteinsstartcomingout.”Asthecolumnruns,thebandswillspreadoutfurtherapart基本原理蛋白质是两性电解质，在一定pH下，可解离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒的大小和形状。第95页,共132页，星期六，2024年，5月由于各种蛋白质的等电点（pI）不同，分子量不同，在同一个pH缓冲溶液中所带电荷不同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。第96页,共132页，星期六，2024年，5月双向电泳-1第97页,共132页，星期六，2024年，5月双向电泳-2第98页,共132页，星期六，2024年，5月双向电泳-3第99页,共132页，星期六，2024年，5月电泳法

（1）区带电泳

（2）等点聚焦电泳

（3）高效毛细管电泳

第100页,共132页，星期六，2024年，5月（1）区带电泳

——在惰性支持物上进行电泳时样品中各组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法

——按支持物的物理性状可分为3种类型：

—膜电泳

—粉末电泳

—凝胶电泳第101页,共132页，星期六，2024年，5月膜电泳

——以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。第102页,共132页，星期六，2024年，5月粉末电泳

——以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。第103页,共132页，星期六，2024年，5月凝胶电泳

——以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。

第104页,共132页，星期六，2024年，5月区带电泳的优点分辨率较好设备简单操作方便第105页,共132页，星期六，2024年，5月（2）等点聚焦电泳

——利用两性电解质在直流电场中形成一个连续的pH梯度，样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的pH区段聚集而达到分离的目的。第106页,共132页，星期六，2024年，5月等电聚焦电泳第107页,共132页，星期六，2024年，5月高效毛细管电泳毛细管电泳是在内径为25~100?m的石英毛细管中进行电泳，毛细管中填充了缓冲液或凝胶。使用毛细管的一个优点是:它减少了由于热效应产生的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。第108页,共13