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牛血清α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）的分离及鉴定

作者：熊洪亮指导老师：孟欣老师

（中国医科大学96期7班沈阳邮编110000）

【摘要】

α1-AT血清中主要的蛋白酶抑制剂，分子量5.6kD，pI为4.7，是一

种糖蛋白。提纯：首先可通过盐析法，将其从血清中提纯，然后可通过凝胶过滤

层析将其与盐分离，达到进一步提纯，DEAE-纤维素离子交换层析再进一步提纯。

活力测定：通过检测对胰蛋白酶的抑制力来测定α1-AT活力。电泳：通过电泳

得到α1-AT蛋白，并在条件允许下测得蛋白质分子量。

【关键词】

α1-AT层析分离纯化电泳

α1－抗胰蛋白酶为一种糖蛋白，由肝细胞制造，分子量5.6kD，体内半衰

期5.6d，在常规蛋白电泳上为α1－球蛋白的最主要成分，其生物学作用在于抑

制胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶、弹力蛋白酶等，为一种广谱蛋白

酶抑制剂。在本次实验中发现：α1-AT具有抑制胰蛋白酶活性的作用，且具有

明显的电泳现象。

一．盐析法

1.材料原理

1.1实验原理：盐析法是一种利用蛋白质在高盐溶液中溶解度不同而分

离的方法因此不同浓度的硫酸铵能将不同蛋白质分离开来。其原理

是：硫酸铵加入蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜

被破坏，使蛋白质从溶液中析出。

1.2仪器与试剂：离心机、真空泵；饱和硫酸铵溶液、固体硫酸铵、牛

血清

2.实验方法

1

○.量取15ml牛血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入硫酸铵溶液15ml，加入

过程并不断用玻璃棒搅拌，然后置于4摄氏度冰箱中放置30min，并做好标

记。

2

○.将上述所得溶液倒入离心管中，做好标记，以3000r/min的速度离心

20min.

3

○.离心后，将上清液倒入一干净量筒中，得24ml上清液，然后倒入一干净

烧杯中，并加入4.2g固体硫酸铵，边加边搅拌，做好标记，在4摄氏度冰

箱中放置30min。

4

○.在布氏漏斗中方两层滤纸，用烧杯中的液体将其润湿，再将烧杯中剩余

的液体倒入漏斗中，于真空泵负压抽滤至龟裂。

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○.刮下滤纸上的沉淀。

3.实验结果：此沉淀即为α1-AT粗提蛋白组分。

4.实验讨论：实验过程中，i)为什么向蛋白质溶液中加硫酸铵溶液，而不

1

1

能反过来添加？我觉得主要有两点原因：○.硫酸铵溶液加入蛋白质溶液

中，在溶液中作用的空间范围大，更利于其破坏蛋白质表面的水化膜，

2

使蛋白质析出；○.硫酸铵溶液能再电离出氨根离子，使溶液呈酸性，饱

和硫酸铵溶液酸性较大，会使蛋白质变性。ii)两次析出沉淀过程中，为

什么第一次使用硫酸铵溶液，第二次使用固体硫酸铵？由沉淀理论可知，

不同蛋白质沉淀对硫酸铵浓度有不同的要求，称为蛋白质的分级沉淀，

如果第二次继续加硫酸铵溶液，溶液的硫酸铵浓度改变就不会很明显，

这样α1-AT蛋白析出效果也不会很好。

二凝胶过滤法层析

1材料原理

1.1实验原理：凝胶过滤法层析又称分子筛层析，混合物流经凝胶时，大

分子因不能进入凝胶网孔而凝胶颗粒间隙流下，由于其所受阻力小，

所以比小分子流速快，本实验利于大、小分子在凝胶中的流速不同而

将他们分开。

1.2实验材料：Sep