一种基于TaqMan探针法的阪崎肠杆菌qPCR全自动检测技术体系的建立.docx

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一种基于TaqMan探针法的阪崎肠杆菌qPCR全自动检测技术体系的建立

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王芬刘宽马龙

摘要[目的]建立快速准确地检测食物样品中食源性致病菌的体系。[方法]配套湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发的微生物分子检测仪，建立一种基于TaqMan探针法的阪崎肠杆菌qPCR检测体系。[结果]体系建立成功，标准曲线斜率为-3.44，R2=0.9955，扩增效率为95.3%。[结论]该qPCR体系特异性强，灵敏度高，明显缩短了检测时间，并具有良好的稳定性与重复性，为食品中阪崎肠杆菌的高通量和自动化检测提供了一个新的途径。

关键词阪崎肠杆菌；qPCR；全自动检测

中图分类号TS207.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）34-0144-04

Abstract[Objective]Toestablisharapidandaccuratedetectionsystemforfoodbornepathogensinfoodsamples.[Method]AqPCRdetectionsystemforEnterobactersakazakiibasedonTaqManprobemethodwasestablished，whichwassupportedbythemicrobialmoleculardetectorresearchedbykeylaboratoryofHuzhoumocrobilogicalagentsandagriculturalproductssafety.[Result]Thesystemwassuccessfullyestablishedandthestandardcurveslope，R2，amplificationefficiencywas3.44，0.9955，95.3%，respectively.[Conclusion]TheqPCRdetectionsystemhasstrongspecificity，highsensitivity，goodstabilityandrepeatability，whichcouldshortenthedetectiontimegreatly.ThesystemprovidesanewwayforhighthroughputandautomateddetectionofE.sakazakiiinfood.

KeywordsEnterobactersakazakii；qPCR；Automaticdetection

近年來随着社会经济的发展以及一些食品安全事件的普遍发生，人们对食品安全问题越来越关注。引起食品安全问题的因素涉及方方面面，而微生物污染是导致食品安全问题的重要原因之一，其中阪崎肠杆菌污染是一种广泛存在的微生物污染。阪崎肠杆菌即克罗诺杆菌属，耐酸、耐干燥、抗渗透压，在食品、饮料、加工材料、环境中广泛存在并且很容易生存[1-4]。国际食品微生物标准委员会（ICMSF）在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”[5]。该菌易引起脑膜炎、小肠结肠炎和败血症等疾病，是引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，死亡率高达50%[6-8]。因此，加强对食品中阪崎肠杆菌的检测对于维护食品安全和维持人体健康尤其是婴幼儿的健康具有非常重要的意义。

目前检测阪崎肠杆菌的方法已有很多，如普通微生物学检测、基于α-葡萄糖苷酶活性的检测、免疫学检测（ELISA、IMB、IFA）和分子检测等。其中分子检测法又包括普通PCR、荧光定量PCR、环介导恒温扩增（LAMP）等方法[9-10]。国标法对于阪崎肠杆菌的鉴定是增菌培养后以TSA平板上产生黄色素为基础进行生物检测，而黄色素产生并不是阪崎肠杆菌所特有的，同时一些研究也表明，自然界中存在一些不产黄色素的阪崎肠杆菌[11]。与国标法相比，qPCR检测技术的特异性和灵敏度要强得多，并且时间会明显缩短。该研究主要基于TaqMan探针法qPCR检测技术，配套湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发的微生物分子检测仪以完成阪崎肠杆菌检测体系的建立。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。试验总共涉及5种菌株，其名称与来源见表1。

1.1.2仪器与试剂。

普通PCR仪为美国BIO-RAD公司生产；台式高速冷冻离心机和加样器均为德国Eppendorf公司生产；微生物智能检测设备为湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发设计；DNA提取试剂盒购