介孔二氧化硅包载香叶木素对IL-1β诱导的大鼠体外骨关节炎的作用研究.docx

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介孔二氧化硅包载香叶木素对IL-1β诱导的大鼠体外骨关节炎的作用研究

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何明为韦庆军

摘要：目的：对比MSNs@DM和单纯DM对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞炎症损伤的作用。方法：提取5天龄的SD乳鼠的软骨细胞进行培养，分为空白对照组（Control），骨关节炎组（OA），香叶木素组（DM），载药组（MSNs@DM），分别处理24小时后，行HE染色观察各组大鼠的细胞形态及数量，并提取各组大鼠的总RNA，行qRT-PCR检测相关炎症的表达。结果：与OA组相比，DM组和MSNs@DM组细胞形态较接近于Control组;在细胞数量上，MSNs@DM组和DM组均比OA组多，而且MSNs@DM组相较于DM组多。MSNs@DM组相关炎症指标基因的表达均低于OA组（P0.05）和DM组（P0.05）。结论：MSNs@DM相比于单纯DM更能有效维持IL-1β诱导的大鼠体软骨细胞炎症损伤的形态，并抑制相关炎症基因的表达，对骨关节炎有积极的治疗作用。

关键词：介孔二氧化硅;香叶木素;软骨细胞;骨关节炎

R-03A2107-2306（2020）01-026-02

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退行性改变为特征的疾病，会引起关节疼痛、僵硬、压痛和活动范围缩小等，是常见的肌肉骨骼疾病之一[1]。目前治疗OA的方式有止痛药物（如扑热息痛和非甾体抗炎药）、手术等[2]。然而这些治疗仅能缓解症状，很难延缓OA的发展。有研究表明，香叶木素（diosmetin，DM）具有较强的抗炎、抗氧化作用[3]，是治疗OA的潜力药物;但是由于DM水溶性差、不利于吸收的特点，药物的实际利用率较低。介孔结构的二氧化硅纳米颗粒（mesoporoussilicananoparticles，MSNs），由于具有极高的比表面积和孔径体积，已被作为药物缓释载体应用于生物医学研究中[4]。因此，本研究以MSNs为载体负载DM（MSNs@DM），研究其对IL-1β诱导的大鼠体外骨关节炎的影响，为今后进一步研究新型的OA治疗方式提供实验依据。

1.材料与统计学方法

1.1材料动物为5天龄SD乳鼠，由广西医科大学动物实验中心提供。主要试剂：MSNs、DM（化学结构式如图1A）购于麦克林公司（http：///）;高糖培养基、胰蛋白酶、双抗、MTT和HE染色试剂盒购买于北京索来宝公司（http：///）;PCR引物合成于武汉金开瑞生物公司;胎牛血清购买于Gibco公司。主要仪器：全波长荧光酶标仪（Thermo，美国）;正置荧光显微镜（Olympus，日本），PCR仪（light-cycler，美国）。

1.2统计学方法以SPSS22.0统计软件处理数据，并以（均数±标准差）呈示。组间比较采用One-wayANOVA，两两比较采用LSD检验，P0.05被认为差异具有统计学意义。

2.方法与结果

2.1DM对IL-1β体外诱导的大鼠软骨细胞炎症损伤的作用

提取SD乳鼠原代软骨细胞进行培养至第3代。将软骨细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，放置于37℃培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，先加入含有不同浓度DM的高糖培養基（含10%胎牛血清和1%双抗）作用2小时，随后更换含有相同浓度DM的高糖培养基（含IL-1β10ng/mL，10%胎牛血清和1%双抗）。作用24小时后，分别向每孔培养基中加入20μL的MTT，继续置于培养箱中4小时后弃掉多余培养基，加入200μLDMSO并避光孵育15-20分钟。最后用全波长荧光酶标仪在570nm处测定光密度值（ODvalue）。结果如图1B所示，DM在20μM时，对经IL-1β体外诱导的大鼠软骨细胞保护效果最佳。

2.2MSNs@DM对IL-1β体外诱导的大鼠软骨细胞炎症损伤的作用

为对比MSNs@DM和DM对IL-1β（10ng/mL）体外诱导的大鼠软骨细胞的作用，我们以MSNs作为药物载体，按照等效浓度为20μM的量将DM载入MSNs中得到含20μM的MSNs@DM。之后，我们将第3代软骨细胞分别接种在6孔板（50×103个/孔）及24孔板（10×103个/孔）爬片中，分别为Control组，OA组，DM组，MSNs@DM组。按如前所述分组分别加入含不同药物成分的培养基作用2小时后，更换含有相应药物成分的且含有IL-1β（10ng/mL）的高糖培养基。在干预24小时后，我们分别取出各组细胞爬片，用PBS缓冲液冲洗3遍后以多聚甲醛在室温下固定20分钟，之后进行HE染色。染色结果如图2，苏木素将细胞核染成蓝色，伊红将细胞质染成红色。同OA组对比，我们发现DM组和MSNs@DM组细胞形态和数量更接近于Control组;并且OA组的细胞形态狭长且数量减少，说明IL-1β能诱导软