鼠疫间接血凝试验和反相血凝试验.pptVIP

**7.1.2.1试剂1）鼠疫F1抗原致敏血球抗原致敏血球为戊二醛固化并经单宁酸处理的羊血球,再以33%饱和度硫酸铵两次盐析提纯的FI抗原致敏。用于间接血凝试验的抗原致敏血球应定期进行试剂质量检测,并符合以下标准a)用细菌凝集效价为1∶320的鼠疫全菌免疫血清,血凝滴度应不低于1∶40000b)与假结核血清交叉滴度应不高于1∶52）单宁酸血球与鼠疫F1抗原致敏血球同一批次的单宁酸血球3）稀释液含1%正常兔血清的生理盐水4）抑制剂含50ug/mL～100ug/mL鼠疫F1抗原的稀释液5）阳性参考血清7.1.2间接血凝试验:测定鼠疫抗体*7.1.2.2标本的准备血清标本应经56℃30分钟灭活,4℃保存、待检,如需长期保存则加入叠氮钠（终浓度为0.1%)或1%硫柳汞（终浓度为1/5000--1/10000）**7.1.2.3操作步骤7.1.2.3.1初筛试验操作步骤1）每份被检血清在V型孔微量血凝板稀释5孔2）用移液器向每孔分别加入25μL稀释液3）在第1孔中加入被检血清25μL,吸排4～6次,充分混匀后,取25μL移至第2孔,充分混匀,依次稀释至最后一孔,弃掉25μL4）分别在各孔内加入1%鼠疫F1抗原致敏血球25μL,振荡混匀。置37℃温箱或室温2h后观察结果*7.1.2.3.2结果判定1）“＃”:凝集血球铺满孔底，有明显折边，抗体过量时，凝集呈疏松花圈状2）“＋＋＋”:凝集血球铺满孔底，无折边3）“＋＋”:血球不完全凝集，在孔底呈整齐的圆圈，但圈内外有非常明显的血球凝集4）“＋”:在孔底形成较小的圆圈，在圈内外只有很少的血球凝集5）“–”:血球全部沉积在V型孔的底部，呈整齐的小珠状呈现“++”以上的凝集现象时，进行以下复判操作***7.1.2.3.3复判操作步骤1）每份初筛阳性的血清在V型孔微量血凝板稀释两列，第一列为血凝抑制试验列，第二列为血凝试验列2）用移液器向第一列每孔内加抑制剂25μL，向第二列每孔内加稀释剂25μL3）用移液器分别取被检血清25μL加入各列的第一孔内，吸排混匀4～6次,，再吸取25μL加入相应列的第二孔内，混匀。依此类推稀释至最后一孔，吸出25μL弃入消毒液中。置37℃温箱10min～15min4）在第一、二列各孔中，用移液器加入稀释至1%的鼠疫F1抗原致敏血球悬液25μL。震荡混匀，置37℃2小时后观察结果。至此，每列第1孔的稀释度为1:4*5）每组同时设下列对照a）空白对照:稀释液25μL+1%鼠疫F1抗原致敏血球25μLb）阴性对照:1:20被检血清25μL+1%单宁酸血球25μLc）阳性对照:稀释的阳性参考血清＋1%鼠疫F1抗原致敏血球25μL6）结果判定方法同7.1.2.3.2空白对照、阴性对照孔不应呈现凝集，阳性对照成立。最终结果，当血凝抑制列呈“++”凝集的孔比血凝试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性血清最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度**间接血凝试验和反相血凝试验

祁腾

四川省疾病预防控制中心*1.鼠疫血清学检验的发展过程1.1二十世纪初鼠疫的诊断主要靠分离病原菌鼠疫菌多在动物鼠疫流行时才可分离到,某些因素如被检材料的腐败程度,鼠疫病人取材前用过抗菌素,鼠疫菌的毒力等都不同程度地影响鼠疫菌的分离。仅靠分离鼠疫菌的方法对鼠疫病人诊断、进行病原检索、动物鼠疫调查等已不能解决问题。后来,发展了细菌凝集和热沉淀反应测定鼠疫抗体或抗原,但由于这些反应特异性差,敏感性低,只能作为辅助诊断方法之一*1.2二十世纪50年代以后Baker提取出了具有特异性的鼠疫菌FI抗原利用鼠疫菌FI抗原或特异性抗体吸附于颗粒性载体（血球、乳胶、炭颗粒等）,形成间接血凝试验技术后来,用单宁酸处理红血球,再吸附FI抗原,提高了敏感性和特异性,WHO（1956）推荐列为鼠疫诊断常规方法之一*1.3二十世纪70年代初鼠疫间接血凝技术在我国得到推广,并大规模用于实践之后用于检查抗原的鼠疫反向血凝试验,也陆续出现我国制备的鼠疫抗体致敏血球可检查2.4万个菌/ml,其特异性和敏感性可与WHO提供的制剂相媲美,已在国内广泛应用*2.1血清学检测是依据抗原或抗体与其相对应的特异抗体或抗原在一定条件下（如适宜的反应介质和温度）可发生免疫化学反应,生成特异的抗原—抗体复合物。主要有直接凝集和间接凝集2.血清学检测的原理*2.1.1直接凝集颗粒性的抗原与相应的抗体反应时,抗