通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建.pptVIP

contents一.背景知识二.内容介绍三.结论通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第1页

一.背景知识

表位附加标识(epitopetag),就是将附加抗原表位融合到目标蛋白以检测目标蛋白表示,同时还能够经过亲和层析法来纯化目标蛋白及利用免疫荧光技术对标识蛋白进行亚细胞定位。本文使用表位附加标识是HA和EGFP。HA标识普通由9个氨基酸组成,它起源于流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA),相对应HA单克隆抗体是12CA51。EGFP（增强型绿荧光蛋白）:在原核或真核细胞中表示并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第2页

当前对四膜虫C端蛋白标识技术已经完成，多数情况下蛋白标识位于C端，这么抗药标识极少会干扰到N端开启子。但其N端蛋白标识技术仍有研究需要。作者先前试验中发觉有些蛋白在C端标识时出现功效异常或干扰与其它蛋白相互作用等。N端蛋白标识考虑方面:1.不会干扰开启子功效2.不会影响下游基因正确翻译3.基因同源重组时N端表位附加不会丢失Cre/loxP重组酶系统能够处理上述问题通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第3页

Cre/loxP重组酶系统Cre是起源于P1噬菌体Cre基因所编码蛋白,属于Int家族。它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列组成称为LoxP特异靶位点,并依据LoxP方向性,可在各种底物(超螺旋环状型,松驰型和线型DNA分子)上介导三种不一样重组事件通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第4页

loxP位点通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第5页

a.基因序列插入(图1A);

b.同向位点之间序列缺失(图1B);

c.两个反向位点之间序列颠倒(图lC)。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第6页

构建思绪可产生Cre酶四膜虫含有LoxP位点且与目标基因连锁一段基因通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第7页

二.内容介绍1.Cre重组酶定位于四膜虫大核中2.Cre重组酶表示抑制了四膜虫生长3.Cre重组酶能够在LoxP位点上发生准确重组4.Cre/loxP系统能够用于N端表位附加通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第8页

1.Cre重组酶定位于四膜虫大核中

为了检测Cre重组酶是否能在四膜虫中表示。作者构建了一个质粒pMNMM3（含可取代內源MTT1基因）并在Cd2+离子诱导下其內源开启子能够表示。同时在cre1基因前加上HA-tag,从而组成PMNMM3-HA-cre1质粒。以此来于野生型四膜虫B2086系进行同源重组。重组子能够用是否含有抗paromomycin(巴龙霉素,与新霉素neo相同）进行筛选。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第9页

插入HA-cre1基因通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第10页

通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第11页

通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第12页

从E图中能够发觉在Cre556（一类含HA-cre1基因表示四膜虫群体）大部分內源MTT1基因被HA-cre1表示结构取代。

在Cre556系中HA-cre1基因能否表示是接下来需要做工作。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第13页

已知HA-Cre1蛋白分子量为39.7kDa。经过westernblotting中利用anti-HAantibody,如图显示CRE556系能够在Cd2+诱导下表示。要注意是CRE556系在饥饿状态下HA-Cre1蛋白表示显著少于养分充分时候。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第14页

免疫荧光检验结果发觉HA-Cre1蛋白或HA-Cre1mRNA能够在结合生殖中从CRE556细胞进入与之结合另一个细胞。这么CRE556系能够被用来诱导与之结合细胞LoxP位点上进行重组。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建第15页

2.Cre重组酶表示抑制了四膜虫生长CRE556系中发觉cre基因表示对四膜虫含有毒性。可能Cre酶是一个核酶原因,而不是因为MTT1基因被HA-cre1基因取代造成。通过CRELOXP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表