不同类型细胞的培养特点课件.pptVIP

第六章个别细胞和组织的培养

类型：正常细胞培养肿瘤细胞培养

第一节正常细胞培养v正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。v正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格.v但只要一切条件适当仍有培养成功可能。

一、上皮细胞类培养v上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；v培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。

v上皮细胞培养有三个难点：①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；②需求特殊培养基；③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。v纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。

(一)表皮细胞培养1．特点：v在有胶原的底物上易生长；v把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。v降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。v向培养基中加氢化可的松(10μg/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。

v【饲细胞】饲细胞(FeederCells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。v饲细胞作用：v有同化营养液的能力。v饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。

饲细胞的制备：(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按10细胞/毫升重新接种3培养；(2)在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素，按2ug/10细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用5射线单次照射，剂量30～50戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104/ml接种入新培养基中；(4)48小时后，即可用于细胞克隆之用。

2．表皮细胞培养程序：(1)取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5~1cm小块；2(2)EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。(3)冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜；(4)分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；

(5)温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30~60分钟；(6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清.(8)培养：接种入碟皿中，CO2温箱培养。

v注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。

(二)胃上皮细胞培养v适于胃上皮细胞生长的条件是：①胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；②应用胶原底物培养；③制备含有特定成分的培养基；

v培养程序：(1)取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许；(2)清洗：用含庆大霉素(400μg/m1)和两性霉素(2μg/m1的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm大小；(3)消化：在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80分钟；(4)离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次；

(5)接种：末次离心后加入含有1％~2％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。v细胞接种后一般在16小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。

(三)肝细胞培养v肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。1．初代组织块培养：v肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm左右的小块，采用贴壁培养3法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。

2．初代消化法培养：(1)把肝组织切成2~4立方毫米的小块，用不合钙镁的BSS液洗两次；(2)移入1:1的0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶(都用无钙镁BSS配制)中，4℃冷消化10~12小时后，通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可)；(3)收集细胞、BSS液洗1~2次、计数、接种培养；

3．肝脏灌流法：v需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)