不同类型细胞的培养特点课件.pptVIP

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第六章个别细胞和组织的培养

类型:正常细胞培养肿瘤细胞培养

第一节正常细胞培养v正常细胞,在体外培养时都不易生长,建立细胞系更难。v正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞,对体外生存条件要求严格.v但只要一切条件适当仍有培养成功可能。

一、上皮细胞类培养v上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层;v培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征,细胞呈膜状生长的特点。

v上皮细胞培养有三个难点:①需求特殊底物,如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长;②需求特殊培养基;③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长,并常压过上皮细胞。v纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。

(一)表皮细胞培养1.特点:v在有胶原的底物上易生长;v把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)上时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。v降低pH、Ca2+的含量和温度等,均利于表皮细胞生长。v向培养基中加氢化可的松(10μg/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。

v【饲细胞】饲细胞(FeederCells)也称滋养细胞,是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。v饲细胞作用:v有同化营养液的能力。v饲细胞能促克隆细胞的生长,利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡,换液时清除。

饲细胞的制备:(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞,90%汇合时制成细胞悬液,再按10细胞/毫升重新接种3培养;(2)在细胞半汇合时,准备0.25μg/ml的丝裂霉素,按2ug/10细胞的量加入到培养瓶中过夜;或用5射线单次照射,剂量30~50戈瑞(Gy);(3)细胞经上述处理后,Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时,胰蛋白酶消化细胞制成悬液,按5×104/ml接种入新培养基中;(4)48小时后,即可用于细胞克隆之用。

2.表皮细胞培养程序:(1)取材:取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5~1cm小块;2(2)EDTA处理:先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。(3)冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜;(4)分离:取出皮块,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开;

(5)温消化:取出表皮单独处理;用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60分钟;(6)制细胞悬液:用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液;(7)加培养液:通过80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清.(8)培养:接种入碟皿中,CO2温箱培养。

v注意事项:冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散;如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散,此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液;不再经过第二次消化。

(二)胃上皮细胞培养v适于胃上皮细胞生长的条件是:①胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞;②应用胶原底物培养;③制备含有特定成分的培养基;

v培养程序:(1)取材:取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许;(2)清洗:用含庆大霉素(400μg/m1)和两性霉素(2μg/m1的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm大小;(3)消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80分钟;(4)离心:收集细胞悬液,800转/分离心后,Hanks液漂洗两次;

(5)接种:末次离心后加入含有1%~2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中;接种量依不同实验目的而定。v细胞接种后一般在16小时内贴壁,细胞呈多角形,成岛状或片状生长,以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3周,第一周末达高峰,最后逐渐衰退剥落。

(三)肝细胞培养v肝脏具有取材方便和易于生长的优点,能获得典型上皮细胞培养。1.初代组织块培养:v肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝剪成1mm左右的小块,采用贴壁培养3法。肝组织易于贴壁,生长力好,一般次日即可出现生长晕。

2.初代消化法培养:(1)把肝组织切成2~4立方毫米的小块,用不合钙镁的BSS液洗两次;(2)移入1:1的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS配制)中,4℃冷消化10~12小时后,通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可);(3)收集细胞、BSS液洗1~2次、计数、接种培养;

3.肝脏灌流法:v需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)

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