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大豆中β淀粉酶的提取、分离纯化、测活及固定化
组员:毛耀俊、毕蜜春、张强、陈人良、吴剑峰、罗琼、陈金德、
漆慧娟
摘要:本文通过一定的试验方法,从大豆中提取β淀粉酶,并进行分
离纯化、测活以及酶的固定化,然后对结果进行分析和讨论。
关键词:大豆、β淀粉酶、分离纯化、测活、固定化
β-淀粉酶是外切型糖化酶,它作用于淀粉时,从淀粉非还原端
开始水解a-1,4-糖苷键,顺次切下麦芽糖单位,遇到α-1,6键的分
支点则停止不前,因此它对淀粉的水解产物是麦芽糖及大分子的β-
界限糊精,该酶作用于底物时,同时发生沃尔登转位反应(Wanlden
inversion),使生成的麦芽糖的由α-型转为β-型。
β-淀粉酶广布于高等植物中(如未发芽的大麦、小麦、燕麦、
大豆、甘薯等)及微生物中,可耐酸。将麦芽汁调节pH值为3.6,
在0℃下可使α-淀粉酶失去活力,而余下β-淀粉酶;β-淀粉酶的
唯一产物是麦芽糖,不是葡萄糖。
大豆是一年生豆科植物,呈椭圆形、球形,颜色有黄色、淡绿色、
黑色等,故又有黄豆、青豆、黑豆之称。大豆最常用来做各种豆制品、
压豆油、炼酱油和提炼蛋白质。豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜
饲料。大豆是豆科植物中最富有营养而又易于消化的食物,是蛋白质
最丰富最廉价的来源。大豆不仅含有丰富的蛋白质、脂肪,还含有丰
富的β-淀粉酶。本文主要通过一定的实验方法,从大豆中提取β-
淀粉酶,并对其进行分离提纯、测活和固定化。
1.实验材料与方法
1.1实验材料
大豆100g、0.04mol/L磷酸缓冲液、0.1mol/L磷酸缓冲溶液、
NaOH溶液(2.5mol/L)、滤纸、5g淀粉、碘液、双蒸水、氯化钾溶液、
豆浆机、玻璃棒、烧杯、漏斗、水浴锅、胶头滴管、滴定管、紫外分
光光度计、饱和硫酸铵。
1.2实验方法
1.2.1细胞的粉碎
利用豆浆机对大豆进行植物组织细胞的破碎,得到大豆粉末。
1.2.2酶的提取
采用磷酸缓冲液按照料液比1:5混合于烧杯中,得到的混合液
进行过滤(过滤2~3次),除掉固体杂质,得到酶的粗提取液。
1.2.3酶的分离纯化
(1)对得到的粗提取液60℃水浴加热,10分钟后取出烧杯。
(2)静置5分钟,烧杯底部沉淀出大豆中含有固体杂质蛋白质,
取上清液于另一烧杯中。
(3)硫酸铵进行沉淀
(4)用磷酸缓冲液对沉淀溶解得到酶的纯化液
1.2.4酶活性检测
(1)取10mL淀粉溶液于小烧杯中,并在溶液中滴入2~3滴碘液
作为指示剂。
(2)将小烧杯中置于60℃水浴锅内,在小烧杯中滴入酶提取液,
观察烧杯溶液中的颜色变化。若颜色褪去,则说明酶活性存在。
1.2.5酶的活力测定
测定原理:淀粉在β-淀粉酶的催化作用下生成麦芽糖,利用麦
芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,生成棕色的3-氨基-5-
硝基水杨酸,测定其吸光度,从而确定酶液中的β-淀粉酶的催化活
力。
测定方法:采用DNS法,在Ph为5.8,温度为40°C的条件下,
取适当稀释酶液与可溶性淀粉作用一段时间,再加入一定量的3,5
二硝基水杨酸溶于0.4mol/L的NaOH溶液中,沸水浴5min后,于波
长540nm处测定吸光度值。
酶的活力定义为:在上述条件下1毫升酶液或1克酶粉,每小时
产生1毫克麦芽糖的酶量为一个酶活力单位。
1.2.6酶的固定化及测活
固定化:2g海藻酸钠放入200ml的烧杯中,加蒸馏水60ml,加
热溶解将浓度为5g/l的酶液加入海藻酸钠溶液中混合,再用注射器
滴入1%的CaCl溶液中,固化1h,然后过滤、洗涤、干燥,得到球状
2
固定化酶。
测活:在盛有含碘液的淀粉溶液中放入制备好的小球状固定化酶
胶粒,若溶液颜色褪去,说明酶有活性。
2.结果与分析
2.1结果
(1)小烧杯中的颜色褪去,说明酶是有活性的;
(2)酶提取液的活力为300u/mL;
(3)成功地从大豆中提取了β-淀粉酶,并将其进行了分离纯化和
固定化最后得到了白色透明的球状固体
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