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建立与高通量测序试剂匹配的简化版院内流程体系

【摘要】目的基于本验室测序平台，建立与肿瘤基因高通量测序试剂性能匹

配的，符合本验室可施的简化版的验证流程体系，为临床验室应用提供

操依据。方法标准流程选取来自不同厂家的6例DNA标准品和2例RNA标准品,

从甲醛固定石蜡包埋(formalinfixationandparaffin-embedding,FFPE)

的肿瘤样本中提取DNA和RNA,按杂交捕获验流程制备文库后进行高通量测序,

通过6次测序分别进行重复验、不同投入量、常见干扰物质等研究，从下机数

据质控、变异类型、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定检出情况进行评估。基于标准

流程的结果，用同一方法原理、检测范围相近的试剂盒检测不同的参考品，制定

用时短、耗资低的简化流程，通过准确性、特异度和灵敏度评估，并参加国家卫

生健康委临床检验中心(NCCL)室间质量评价活动。结果标准流程试剂验证评

估合格，参加NCCL室间质评合格，但耗时长耗资大；简化流程试剂准确性、特

异度、灵敏度评估合格，参加NCCL室间质评合格。结论基于本验室建立了

简化可行的肿瘤基因检测试剂盒性能确认流程，为院内开展肿瘤基因检测及其临

床应用提供了验室依据。

肿瘤是造成死亡的重要原因，肿瘤治疗已进入针对分子靶点的个体化医疗时

代。随着基因检测技术的快速发展，目前广泛应用于临床的高通量测序也叫二代

测序(next-generationsequencing)技术具有高通量、高灵敏度、基因覆盖

广等优势,在肿瘤基因突变筛查、肿瘤分子生物学研究方面具有重要作用［1-3］。

近年来，多个专家共识推荐，针对不同肿瘤使用二代测序的方法进行基因检测，

可为肿瘤分子靶向治疗和免疫治疗提供依据［4-6］。根据基因数量及检测类型,

高通量检测涵盖了体瘤靶向治疗相关基因突变，包含单核甘酸变异(single

nucleotidevariation,SNV)、插入/缺失变异(indel)、基因融合(fusion)

和拷贝数变异(copynumbervariation,CNV)等多种基因类型［7-13］,同

时可检测肿瘤突变负荷(tumormutationalburden,TMB)、微卫星不稳定性(m

icrosatelliteinstability,MSI)和DNA错配修复基因(mismatchrepair,M

MR)等，可满足临床及患者需求。

基于检测质量可控、生物信息安全、数据可溯源等多种原因，越来越多的医

院选择了自行开展肿瘤基因的二代测序检测。然而，确认试剂盒的准确性和性能

是确保其可靠应用的关键步骤，在验室方法和程序用于临床测试之前，其性能

确认或性能验证为获得安全有效的检测结果至关重要。Matthijs等［14］在二

代测序诊断指南中，明确提到：如果没有根据新指南对试剂进行合理验证，二代

测序不应该运用到临床践。同样，国内《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中

的应用专家共识》［15］也提出，二代测序项目的检测流程和生物信息学分析需

要针对特定平台和分析项目进行充分优化，流程验证中应提供分析灵敏度和特异

度的参数。因此，为了规范肿瘤基因检测进院流程，确认试剂盒性能是进院检测

的第一步。但肿瘤基因检测流程复杂，检测项目涵盖内容极多，现有的分子遗传

学检测的标准和践指导仍然缺乏对试剂检测具体的解释和规范［16-17］o不

同的医院，分子病理验室检测条件也不尽相同。因此，基于本地验室的条件,

建立适用于本地验室的肿瘤基因试剂盒性能的相关流程显得十分必要。

一、材料与方法

1.材料：(1)标准流程研究：标准流程参考Kroeze等［18］的方法，验

试剂使用TruSightOncology500Panel(美国Illumina公司)，检测范围为

常见体瘤相关523个基因，包含MSI、TMB评估，目前正在向美国食品药品监

督管理局提交申请批准作为伴随诊断试剂。试剂盒和测序芯片试剂均在有效期内,

并在规定的条件下运输和保存（-20°C）,外观包装完好。文库构建方法基于杂

交捕获原理，选取6例来自不同厂家的DNA参考样本，分别代表了不同类型肿瘤

组织、TMB和MSI水平以及携带多重突变的综合组合；2例RN