分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性.pdf

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。

蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种

酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。

【实验原理】

蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。

UDPG+果糖蔗糖+UDP

这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高

（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定

既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以

在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：

UPDG+F6P蔗糖-6-P+UDP+H+

6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS

和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性

测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分

解的。

果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应

液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在

480nm处可比色测定。

【实验材料】

植物茎

【仪器设备及设备】

冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），

0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱

【试剂药品】

1.提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl

2,2mmol/LEDTA-Na2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。

1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

【配制方法】用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过

滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

2.透析缓冲液：25mmol/LTris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含

2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。

3.酶反应液：100mmol/LTris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果糖（10mol/L果糖

-6-磷酸代替果糖）2mmol/LEDTA-Na2,5mmol/L醋酸镁，5mmol/LDTT。

5mMTris-HCl配法：50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与45.7毫升0.1M盐酸混匀后，加水

稀释至100毫升。这是pH7.1的您要7.0的话便再加一些HCl用pH计调到7.0。.50mMNaClpH=7.0配法：

端直称2.92gNaCl，加水到1L然后用0.1M盐酸或者0.1MNaOH调pH到7.0

4.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随

用。尿苷二磷酸葡萄糖

5.2mol/LNaOH

6.30%HCl

7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。

8.1mg/ml蔗糖标准液

【方法步骤】

1.酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴

研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液

中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。

2.蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和