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WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）

1流动相的处理

1.1过滤溶剂

溶剂在使用前要用过滤器过滤，有机相和纯水相通常可以不过滤，

如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能

让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。同时一些缓冲盐溶液

过夜后易生菌，使用前要抽滤或者重新配制。实验室应有水溶性和脂

溶性两种过滤膜供选择（反光面朝上），过滤水相时，要先用1-2ml

水润湿过滤膜，有助于快速抽滤。

1.2保持储液瓶的清洁

用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用

HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。流动相瓶子

要保持清洁。

1.3保证溶剂的质量

一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用

高纯度的缓冲盐。

1.4故障及解决方法

1.4.1流动相脱气不充分

流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进

入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方

法解决问题：a、流动相再脱气；b、采用更有效的脱气方法（如抽滤）

或两种方法配合使用；c、改系统内混合为系统外预混合。

1.4.2流动相供给不畅

流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液

器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上

装滤头沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上

下移动。

过滤器阻塞会引起管道和泵腔进气泡，压力不稳。压力不稳时，

如果已经排除流动相混合不均匀的状况，则观察滤头外部是否长毛

（一般水相滤头易长毛），去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已

找出问题，是过滤器被微粒所阻塞或长霉。解决方法：a、换上新的

过滤器（滤头）。b、将滤头拆下，先用纯水超声15min，再换50%甲

醇水溶液超声，再换纯甲醇超声，如果是水相的滤头，在安装前还需

要用纯水超声。如果上述还不能解决问题，则使用10%稀硝酸水溶液

超声滤头，可起到除去菌类微生物的作用。

1.4.3检测器和流动相管路被污染

由于污染，噪音越来越大，检测器被污染。解决方法：拆下柱子

装上双通，分别用纯水、50%甲醇、纯甲醇冲系统，如果基线仍然噪

音很大，则改用异丙醇冲系统（两个泵分开冲），冲完要分别用纯水

和有机相顶去两个泵里的异丙醇。

一些缓冲盐流动相易生菌，长时间使用会使流动相管路滋生微生

物，所以仪器长时间不用最好让水相的泵用50%甲醇冲，如果系统内

生长了微生物，可用稀硝酸冲洗既可（注意不要损坏柱和管道系统）

真空脱气时防止泵油带入流动相。用清洁的惰性塞子、搅棒、过

滤器和玻璃器皿配制流动相。已经污染的流动相一定要废弃掉。

2高压输液泵的操作

2.1液相色谱系统泵的流速在0.1-10.0ml/min之间，要保持泵的良好

操作性能，必须维护系统的清洁，保证溶剂和试剂的质量，流动相的

过滤和流动相的脱气。下面列出预防泵故障的注意事项：（1）用高质

量的试剂和HPLC级溶剂；（2）过滤流动相和溶剂；（3）脱气；（4）

工作时使用泵头的排水孔不停的用10%甲醇/水的混合溶剂冲洗柱塞

杆；（5）不让水和腐蚀性溶剂滞留在泵中；（6）定期更换垫圈；（7）

加润滑油。处于良好操作状态的泵，应该使色谱图上的基线平稳，保

留时间的重复性良好。等度洗脱时压力波动小于±2%。梯度洗脱时

压力变化应是缓慢和平稳的。

2.2常规准备工作包括：开通电源，溶剂脱气，泵头及溶剂管路除

气泡及泵的启动。

2.2.1接通系统电源，控制器开通后进行自检，数秒后通过，接受操

作指令。

2.2.2溶剂瓶脱气（purge）

2.2.3编写等度（Isocratic）或梯度（Gradient）洗脱程序，以初始梯

度（等度）比例平衡柱子10min，待系统平衡后开始实验。

注意，使用含缓冲盐的流动相时，一定要用纯水相过渡。如用磷酸盐

缓冲液作为水相，以30%水相-70%有机相等度洗脱时，要先用30%纯水

-70%有机相平衡15min左右，再换上含盐水相。这是因为做完实验冲

柱子时，柱子最后要保存在80%有机相中，如果第二天一接上柱子就

换上含盐流动相，容易使盐在柱子中析出，造成柱压急剧升高，损坏

柱子。梯度洗脱也是如此，要先用纯水相-有机相以初始梯度比例平

衡柱子再换上含盐流动相。

3实验结束对柱子进行冲洗，如使用了含盐的流动相，要先用等比

例或者是水相稍高的比例将柱子中的盐洗