支原体“现形记”：培养、指示、PCR.pdf

支原体“现形记”：培养、指示、PCR

支原体，细胞培养人员的梦魇，堪称细胞培养界的“隐形杀手”。

支原体就像慢性毒药一样，杀细胞于无形之中。经常悄然潜入细胞培

养体系，无声无息的毁掉细胞。除了经验丰富的实验室老手，一般人

难以察觉支原体污染。

科研方面，Nature、Cell等期刊高度重视细胞培养实验中的支原体

检测信息。目前许多国家有相关的法规，确保源于细胞培养的产品无

支原体污染。因此，支原体检测作为生物制品开发生产的重要质控指

标，贯穿原材料、细胞库、病毒种子库、终产品等过程。

接下来，我们将全方位归纳支原体污染的知识点，并揭开其神秘面纱，

以便我们及时识别和处理支原体污染。

防不胜防的支原体

支原体（Mycoplasma）是目前发现是最小原核生物，大小为0.1-0.3

μm，可以在过滤膜（0.22-0.45μm）自由穿梭，即常规过滤除菌对

其无效。

支原体无细胞壁，造成大多数抗生素对其无效。抗生素的主要作用机

制之一：抑制细胞壁合成。

支原体细胞形态存在差异，有球形、杆状、拉丝、分支等。常规显微

镜难观察到支原体的踪迹和内部结构，电子显微镜能观测到。

细胞培养上清液中的支原体污染

（A.支原体模式图；B.荧光显微镜下被污染的大鼠细胞，箭头所示为支原体。源自参考文

献：doi:10.3390/cell

支原体种类繁多，已超过180种，其中20多种能够污染体外培养的

细胞。但据统计实验室95%以上的支原体来自这6种：人源的口腔支

原体、发酵支原体、人型支原体，牛源的莱氏无胆甾原体和精氨酸支

原体，以及猪源的猪鼻支原体。

支原体不能被革兰氏染色，可在琼脂平板上形成“菌落”，并被甲基

蓝染色。

支原体在琼脂平板形成的“煎蛋菌落”

（源自参考文献：doi:10.1038/nprot.2010.43）

支原体分布广泛，附着在器皿表面，不需要寄生，在无生命的培养基

中“自由”生长繁殖，因此防不胜防。

支原体污染的严重性

支原体污染隐蔽性强。污染初期支原体与细胞共存，培养的细胞状态

没有明显变化，死亡率也不会增加，培养基不发生浑浊。等发现异常

时，可能已经多次传代，难分清是在哪一代出现的污染。导致无法根

治，只能从头再来。

支原体污染影响实验结果。支原体抑制细胞生长，导致染色体畸变，

细胞抗原性改变，复苏后存活率降低等。支原体污染还会影响细胞代

谢和功能，造成细胞蛋白质、DNA、mRNA等合成障碍。

支原体（橙色）可以包围并感染细胞并使基因表达研究的结果无效

（源自参考文献：doi:10.1038/511518a）

支原体污染增加成本。发现不及时往往意味着大量时间、精力和金钱

的浪费，尤其是对于生物制药企业来说更是后果严重。支原体污染可

能造成生物制品产量降低、品质下降，甚至整批产品都需丢弃，生产

车间也需停产整顿。

细胞库支原体检测是生物制品工艺流程的重中之重。企业在细胞库进

入GMP车间前，应做好细胞库支原体和病毒检定，生产过程中完成对

细胞收获液的检定。细胞库一旦发生支原体污染，需要开展相应调查，

对所有可能风险区域进行清洁，并制定相应预防措施，相应区域无法

开展生产工作。因此从细胞株构建开始，就应做好支原体检测，从源

头杜绝污染。

如何检测支原体

细胞培养过程中，出现细胞生长变缓、状态变瘦、细胞黏连、出现拉

丝铺展等情况时，可能存在支原体污染。支原体污染可能来自操作人

员和细胞培养用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能来自于本身已被污

染的细胞系和毒种。

支原体污染检测技术常用的有：

1.直接培养法：将待测样品涂布在支原体固体培养基上，阳性会出

现“煎蛋菌落”；

2.指示细胞法：DNA荧光染色检测法：污染的细胞染色后会看到细

胞周围有荧光小点或丝状物；

3.核酸检测法（NAT）：常规PCR、qPCR，根据支原体基因组内的保

守序列设计特异引物，对待检样品的核酸进行扩增。

检测方法优势劣势

直接培养法灵敏度高，可达1-10·培养期长达28天

CFU/mL支原体·存在漏检风险

指示细