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核酸分离纯化的技术原理

核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。核酸提

取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。核酸提取主要有两个

步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细

胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特

异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多

肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。在核酸提取过

程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他

污染分子。

一、液相核酸分离纯化技术

（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法

盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本

进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。因此，通常需一或

多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。核酸纯化的常规步骤包括

细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包

括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得

纯净的核酸样本。有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常

见的核酸经典提取方法之一。苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后

（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制

RNA酶活性的不足。蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取

苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。含有DNA样本的水相可通

过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的

DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。异硫

氰酸胍（guanidiniumisothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见

于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰

酸酚-氯仿提取法（guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform

extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。其基本原理是：硫

氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶

的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA

与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。

（二）碱性提取方法

碱裂解（alkalinelysis）主要用于质粒DNA的肠杆菌DNA提取。

其基本原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA

发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状

态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心

时沉淀下来。

（三）CTAB提取法

去污剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，

一般具有乳化、分散和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去污剂

等多种类型，中性去污剂在蛋白提取中应用的较多。十六烷基三甲基

溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）是一种阳离子去

污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在

这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶

液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，

只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机

体如植物以及某些革兰阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化

DNA。

（四）溴化乙锭-氯化铯梯度离心法

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用方法是氯化铯梯度

离心法，它利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状两个性质。溴化

乙锭-氯化铯梯度离心法分离质粒和染色体DNA取决于溴化乙锭与线

状和闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入碱基之间而

与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，

作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大

为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，

可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1

个溴化乙锭分子）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分

子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年

来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选

方法。然而，该过程既昂贵又费时，为此发