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水稻转基因实验操作手册整理--第1页

水稻转基因实验操作

一、水稻愈伤组织的诱导（）

以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织

1．消毒：

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：

1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；

2）倒去酒精，加入100ml3%次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），

放入摇床振荡60分钟；

3)倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。

2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）

1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；

2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；

3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密

呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在

原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)

二、预培养

将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。预培养基碳源

为20克蔗糖+20ml50%葡萄糖（115度灭菌30min）。乙酰丁香酮（AS）浓度为100μM(每

毫升培养液中加入100mM的AS1微升)

三、农杆菌（工程菌）培养

把-70℃保存的菌种首先用含125mg/L壮观霉素、50mg/L利福平的YEB液体培养

基，在26-28℃，150r/min振荡培养16-18h，活化转入打靶载体的农杆菌。

在预培养的第2天，用含125mg/L壮观霉素、50mg/L利福平的YEB固体培养基

划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2-3d。3d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体

培养基或者AAM培养基，28℃振荡培养3～4h。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓

度调至0.5-1.0OD

600

四、感菌与共培养

1）将预培养后的愈伤组织接入100mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30

分钟，期间摇动数次；

2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；

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3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。19-20℃（组培

室）暗培养3天。

五、愈伤组织的抗生素筛选

将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗4次，然后加入无菌水浸泡10min,

使愈伤内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min。再用含

400mg/L头孢的无菌水冲洗一次，最后置于无菌滤纸上沥干3h。

第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含400mg/L羧苄青霉素（Car）和400mg/L头孢霉素

的选择培养基（没有选择压力）上，26℃暗培养5-7天；

然后将愈伤转到含400mg/L羧苄青霉素（Car）、400mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的

培养基上进行选择，26℃，暗培养，两周一次，培养两次。

六、抗性愈伤组织的诱导分化和生根