总结-各种实验方法的作用.pdfVIP

总结-各种实验方法的作用--第1页

1.蛋白质免疫印迹（WesternBlot）

蛋白质免疫印迹（WesternBlot）可以：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定

量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋

白质-RNA相互作用后续分析。

实验方法Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方

原理法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过

融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，

被检测物是蛋白质，探针“”是抗体，显色“”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体

以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固

相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的

第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的

蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

2.聚合酶链式反应（PCR）

标签：聚合酶链式反应PCR

PCR技术可用于：（1）检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；（2）有效检

测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；（3）临床应用于检测地中海贫血的基

因突变。

实验方法PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补

原理的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经

PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准

备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，

引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序

列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复

总结-各种实验方法的作用--第1页

总结-各种实验方法的作用--第2页

制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链“”，而且这种新链又可

成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩

增放大几百万倍。

3.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

标签：逆转录RT-PCR聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，

RT-PCR）可以：(1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA

探针；（4）构建RNA高效转录系统。

实验方法逆转录-聚合酶链反应(Reverse