《医学分子生物学》课件 第十二章 基因诊断.ppt

*第三节传染病的基因诊断*一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（HAV）HAV系RNA病毒，利用RT－PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。乙型肝炎病毒（HBV）设计保守区序列引物，扩增各型HBVDNA片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBVDNA，以便分型。丙型肝炎病毒（HCV）HCV为正链RNA病毒，先逆转录成cDNA，再进行巢式PCR检测HCV。*二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一383bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。幽门螺杆菌（HP）主要采用PCR技术：①检测HP染色体DNA特异片段；②检测HP尿素酶A基因；③用PCR-RFLP鉴别HP菌株。*三、寄生虫及衣原体感染疟原虫卡氏肺孢子虫衣原体感染诊断方法：核酸杂交和PCR技术*第四节肿瘤的基因诊断一、原癌基因与抑癌基因的检测二、常见肿瘤的基因诊断乳腺癌结肠癌*一、原癌基因与抑癌基因的检测1．原癌基因的检测：ras基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、GTT或GAT，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。*2.ras原癌基因突变常用的检测方法：PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras基因第12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位密码子点突变。*3．抑癌基因p53的检测：p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因蛋白。p53的基因诊断方法有：（1）PCR-SSCP（2）DNA序列分析（3）PCR-RFLP*（一）乳腺癌1．乳腺癌常见基因变异5%～10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（breastcancergene）的突变。BRCA1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。BRCA1在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危有关。BRCA2基因在30%～40%的散发性乳腺癌有杂合性缺失（LOH）。突变提高乳腺癌易感性。二、常见肿瘤的基因诊断*2．乳腺癌基因诊断方法（1）PCR法检测BRCA1基因突变（2）荧光原位杂交（FISH）检测BRCA2基因扩增。*（二）结肠癌1．结肠癌常见基因变异：在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。APC（adenomatouspolyposiscoli）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。K-ras原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。DCC（deletionofcolorectalcancer）基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能会因18q等位基因丢失而失活。p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。DNA修复基因也与结肠癌有关。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突变所致的DNA错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。*2．结肠癌基因诊断方法（1）PCR-SSCP法：对腺瘤样息肉病人APC基因PCR-SSCP技术进行分析。（2）异源双链PCR法：检测APC基因变异。（3）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩短了的APC蛋白。*第五节基因诊断在法医学上的应用*重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。串联重复序列散在分布于染色体上。重复单位6～25bp长，称