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荧光定量PCR

LT

5XPrimeScriptBuffer（forRealTime）4.0

RNaseFreedH2O4.0

Total20

按表成分在冰上配制反应液。为了保证反应液配制的准确性，进

行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装

10μＬ到每个PCR反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

反转录条件；37℃15min；85℃５sec；4℃24ｈ。经

过反转录反应得到的cDNA浓度为50ng/μL，将反转录产物于４℃

冰箱中保存。

2.实时定量PCR扩增

本试验应用CFX96TMReal-TimePCRDetectionSystem扩増

仪的操作方法。使用TaKaRaSYBR⑧PremixExTaqTMⅡ（TLi

RNaseHPlus）进行实时定量PCR扩增。

（1）实时定量PCR反应体系

以上一步反转录获得的cDNA为模板，按表组份配制ＰＣＲ反

应液（反应液配制在冰上进行）。以GAPDH基因作为参照基因，对

样品中MyHCⅠ、MyHCⅡａ、MyHCⅡｂ、MyHCⅡｘ基因在RNA

水平进行相对定量分析。目的基因与管家基因分别做３-４个平行样，

每个岁龄的羊做10只平行，４次重复。

PCR反应体系如表：

（2）将配置好的反应体系装入12排八联管中，放入实时定量PCR

仪中进行扩増。

设置ＰＣＲ反应条件为：

（3）经ＰＣＲ扩増反应后，将产物于４℃冰箱中保存。

3.PCR反应产物检验

吸取2μL的PCR反应产物，加入6XLoadingBuffer混匀，点

入1.0%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，用凝胶成像系统检测

PCR反应产物的质量。

五、数据统计分析

实时定量PCR数据分析方法：本试验采用２-△△Ｃｔ法，计算

公式：（１）相对表达量（foldchange）＝２-△△Ｃt；（２）△

△Ｃｔ＝（Ｃｔ目的基因-Ｃt内参基因）处理组-（Ｃt目的基因-Ｃt

内参基因）未处理组。

1.紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶

液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处

的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

（1）浓度测定

A260下读值为1表示40μgRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算

公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。具体计算如下：

RNA溶于40μlDEPC水中，取5μl，1:100稀释至495μl的TE中，

测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或

0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA

总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg

（2）纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8

到2.1。

2.变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS

电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)

10×MOPS电泳缓冲液

浓度成分

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