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小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

实验背景：

一、细胞培养的基本条件：

1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工

作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素

2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清

3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器

4.细胞保存条件：液氮罐

二、净化工作室：

我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准

尘粒最大允许数/立方米尘粒最大允许数

洁净度

级别

浮游菌/立沉降菌/

≥0.5um≥5um

方皿

1003,500051

10,000350,0002,0001003

100,0003,500,00020,00050010

300,00010,500,00060,000NA15

1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气

得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除

菌。

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3.CO2培养箱：

CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液

蒸发。

三、细胞培养用液的配制：

1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水

2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0g

KCl0.2g

Na2HPO4.H2O1.56g

KH2PO40.20

加水至1000ml

3.消化液：

①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞

骨架，从而使细胞分离。

②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是

0.25％。用滤器过滤除菌。

④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用

4.培养基：

培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

①天然培养基：

天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

优点：营养成分丰富，培养效果好

缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污

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染。

②合成培养基：

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许

多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。

合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

③人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养

基（如血清）。

血清中含有：