《柑橘衰退病毒基因型鉴定技术规程》.docx

1

柑橘衰退病毒基因型鉴定技术规程

1范围

本文件规定了实验室鉴定柑橘衰退病毒基因型的RT-PCR技术要求。

本文件适用于柑橘类植物感染柑橘衰退病毒的RT-PCR检测和基因型鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB5040柑橘苗木产地检疫规程

3术语与定义

3.1柑橘衰退病毒Citrustristezavirus，CTV

柑橘衰退病毒是引起柑橘衰退病的病原病毒，属于长线形病毒科（Closteroviridae）、长线形病毒属（Closterovirus）。

3.2反转录·聚合酶链反应ReverseTranscription-polymeraseChainReaction,RT-PCR

是将RNA的反转录(ReverseTranscription)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

4柑橘衰退病毒基因型信息

柑橘衰退病毒颗粒细长弯曲，粒子大小约为11×2,000nm。病毒基因组由一条长约19.3kb的正单链RNA（+ssRNA）所组成。柑橘衰退病毒存在复杂的株系分化现象，包括VT、RB、

T3、T30、T36、T68等不同基因型的株系。

5方法原理

根据柑橘衰退病毒外壳蛋白基因（Coatproteingene,CPG）内的保守区域设计特异性引物CPG-F/CPG-R，通过RT-PCR检测样品是否携带柑橘衰退病毒。然后利用柑橘衰退病毒VT、RB、T3、T30、T36、T68六种基因型的特异性引物，对已经确定携带柑橘衰退病

毒的样品进行RT-PCR，并根据凝胶电泳结果进行基因型鉴定。

2

6田间症状识别

柑橘衰退病的田间症状具有一定的复杂性，根据指示植物表现的表型可分为3种症状类型：苗黄型（Seedingyellow，SY）、速衰型（Quickdecline，QD）和茎陷点型（Stempitting，SP）。其中苗黄型会引起幼苗的黄化，速衰型引起根系死亡，造成整个植株的快速死亡，田间以茎陷点型症状发生较为普遍，主要引起甜橙、柚类和柠檬等柑橘的木质部出现黄褐色斑点并伴有凹陷，严重时陷点呈蜂窝状分布，造成树势衰弱、果实产量降低和品质下降，导致果树丧失经济价值。具体症状特征见附录A。

7鉴定方法

7.1样品采集与保存

7.1.1田间果园疑似症状植株样品取样，优先挑取疑似症状叶片。若未发现疑似叶片，即按照树冠东、南、西、北四个方向采集，每点取中下部成熟嫩叶五片，每棵树共采集叶片20张。

7.1.2苗圃取样时优先挑取疑似症状植株，未发现疑似症状时可按照抽检方规定抽检率随机抽取一定数量的植株，每株种苗抽取中下部成熟嫩叶5片。

7.2样品的保存

采集的样品分别用样品袋进行分装，放入适量浸润的纸巾进行样品的保湿，做好每个样品的记录，将样品记录和样品3d内一并寄送实验室进行检测。对接收样品进行登记编

号，存放于4℃条件下，及时进行样品RNA核酸抽提。

7.3主要的设备仪器和试剂

7.3.1设备仪器

普通PCR扩增仪。

7.3.2主要试剂

除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯。

特异性引物对（10μM）

RNA酶抑制剂（40U/μL）

反转录酶（5U/μL）

TaqDNA聚合酶（5U/μL）

TRIzolReagent核酸提取试剂

绿色核酸染料

3

7.4样品的预处理与核酸抽提

7.4.1样品的预处理

每份样品选取5片叶片。使用一次性刀片，切取叶片中部主脉及侧脉部分，每份样品

取样重量控制在0.1g左右。

7.4.2样品的RNA提取

按照以下步骤进行：

（1）取0.1g带有叶脉的叶片部分，迅速将叶片投入液氮中，然后放入研钵中迅速研磨直到成为粉末状；快速挑取研磨好的粉末置于含有1mLTRIzolReagent裂解液预冷离心管中，并剧烈混匀，4℃静置15min；

（2）4℃,12900r/min离心10min，取上清液约800μL于1.5mL无酶离心管中，加入约1/5体积预冷氯仿:异戊醇（24:1），剧烈震荡后4℃静置5min；

（3）4℃,12900r/min离心5min，取上清约400μL转至新1.5mL无酶离心管，加入等体积异丙醇，并轻柔混匀，置于-20℃冰箱静置沉淀2h以上；

（4）4℃,12900r/min离心10min，去上清，加入1mL预冷75%酒精进行清洗，4℃12900r/min离心3min，去