激光共聚焦扫描显微镜原理功能ppt课件(优质课件2圆).ppt

***经过之前的课程，我们知道LSCM其实是个荧光显微镜，那么既然是荧光显微镜，我们的一切观察都要对象就是荧光，所有的样品上都要有荧光，这也是荧光显微技术的基础。总之，激光扫描共聚集显微镜主要用于测定具有荧光的样品，因此对本身没有特征荧光的生物样品，就需要用荧光标记的方法使样品中待测物质具有荧光，然后再进行检测。首先我们了解一下荧光的一些基础知识。荧光：物质吸收能量后所释放出的冷发光现象。通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光荧光光谱：激发光谱—通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。发射光谱—荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。任何一个荧光物质都有两个光谱，如FITC，它的最大激发波长为488nm，最大发射波长为525nm，这也就是我们常说的蓝色激发绿色。不同的荧光物质其荧光光谱是不同的。利用这个特性，可以给不同的物质标记不同的荧光素，同时进行检测。**组织和细胞中荧光来源自发荧光：指组织细胞不经任何荧光染色便能够在短波长光的激发下发射出的荧光。很多动植物本身就具有自发荧光，尤其是植物。GFP就具有自发荧光，其是标记靶蛋白的特异性荧光探针。荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。有些可做活体染色。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。外源性荧光物质进入组织内产生的荧光：某些药物例如，阿霉素。诱发荧光：生物胺类能与某些醛类物质在一定条件下缩合而发生荧光，称之为诱发荧光。酶致荧光：某些酶的反应产物能够发射荧光。总之，激光扫描共聚集显微镜主要用于测定具有荧光的样品，因此对本身没有特征荧光的生物样品，就需要用荧光标记的方法使样品中待测物质具有荧光，然后再进行检测。****在了解荧光及荧光光谱的相关知识以后，我们就要对我们所观察的样品进行荧光标记。荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。荧光探针如何选择关系到实验的成败。1.根据实验目的确定需要检定的指标：实验中选择使用何种探针由实验目的决定。例如测钙。2.确定可供选择的荧光探针的范围：根据需要检测的指标，选择应用成熟的探针或标记方法。可通过查找权威的文献或国内外试剂公司产品目录确定可以标记待测物的荧光探针种类或范围。例如美国分子探针公司的网址是。3.考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求，需要考察荧光探针的特性：①荧光探针与样品的反应特性；②荧光探针的灵敏度和荧光强度；③荧光探针标记后样品的光谱特征；④荧光的稳定性；⑤样品中多重荧光的相互影响。4.考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况**在了解荧光及荧光光谱的相关知识以后，我们就要对我们所观察的样品进行荧光标记。荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。荧光探针如何选择关系到实验的成败。1.根据实验目的确定需要检定的指标：实验中选择使用何种探针由实验目的决定。例如测钙。2.确定可供选择的荧光探针的范围：根据需要检测的指标，选择应用成熟的探针或标记方法。可通过查找权威的文献或国内外试剂公司产品目录确定可以标记待测物的荧光探针种类或范围。例如美国分子探针公司的网址是。3.考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求，需要考察荧光探针的特性：①荧光探针与样品的反应特性；②荧光探针的灵敏度和荧光强度；③荧光探针标记后样品的光谱特征；④荧光的稳定性；⑤样品中多重荧光的相互影响。4.考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况******之后我们进行样品的制备，目前我们平台上常用的样品为组织切片和细胞标本，因此我们主要讲一下这两方面的试验中特别室需要用激光共聚焦显微镜进行观察时应该注意的问题。组织切片：切片的厚度4-50um①冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低，引入杂质干扰少，缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。②石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。细胞标本：①细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果，这种现象在原代分离和培养细胞中尤为常见，因此实验中应注意鉴别细胞的种类和纯度，采用相应的方法对细胞进行纯化。②细胞密度的形态：根据实验目的调整细胞的接种密度，如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度可以稀疏一些，但不可低于20％；如果是测定荧光强度，则细胞密度应高一些，以便做大量细胞的统计定量，细胞约占视野面积的80％。③承载细胞的器皿：petri皿（又称glassbottom