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质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化

一、实验目的：

1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

2、初步了解DNA纯化的原理。

二、实验原理

1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，

通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆

地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后

代。

2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量

纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用

碱裂解法提取质粒DNA。

3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当

菌体在NaOH和SDS溶液裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入和液后，

质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清；蛋白质与染色

体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二

醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经

过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，

所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及

探针标记等要求，故在分子生物学实验室常用。

三、实验步骤

1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）

2、将试管放入恒温震荡培养箱，37℃，200r/min培养12-16h。

3、将菌落转入1.5ml离心管（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）

4、重复一次第三步的过程

5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1100微升，剧烈震荡打散菌体

6、加入新配置的Solution2200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，

使液体由浑浊变为透明粘稠

7、加入预冷的Solution3150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之

后在1200r/min离心7min

8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管（400-500微升）

9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另

一离心管

10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min

下离心10min

11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清

12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥

13、加入1*TE40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等

实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术

2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理

1、关于电泳技术：电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构

象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为

生物化学和分子生物学应用最为广泛的技术之一，其在分子生物学实验

最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围

很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳

技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5％

到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于

较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。

2、琼脂糖凝胶电泳条带的观察：通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA

的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的

双链DNA片断相同