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透明质酸HA(HyaluronicAcid)是由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D

-氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖[1]。由于其具有特殊的生理作

用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域

得到了广泛的应用[2,3]。微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞

外分泌以HA为主要成分的荚膜来生产HA。与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受

动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的

致病病毒污染的危险等优点[4]。利用链球菌发酵法生产HA的研究主要集中在日第2期

邓开野,等:透明质酸产生菌的筛选及诱变本,英美等国也有少量报道,大多见于专利。作者对牛

鼻黏膜进行了透明质酸产生菌野生型的分离,同时利用复合诱变育种方法处理HA产生菌,以

期得到既不产生乙型溶血素、HA产量又有提高的发酵HA所适用的菌种。

1实验材料

采集的样品为长春皓月肉牛公司和海南省三亚市防疫站的牛鼻黏膜140份。培养基有以下

几种:①斜面培养基。牛脑沁液800mL,牛心沁液200mL,牛肉膏的质量分数为0.3%,蛋

白胨为1%,NaCl为0.5%,琼脂为1.8%,灭菌前pH=7.0,121℃灭菌20min。②血

琼脂平板培养基。葡萄糖的质量分数为2%,蛋白胨为1%,牛肉膏为1%,MgSO47H2O·为

0.1%,KH2PO4为0.2%,琼脂为1.6%,灭菌前pH=7.0,121℃灭菌20min.,冷却至

50℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。③摇瓶培养基。葡萄糖的质量分数为4%,蛋

白胨为1%,牛肉膏为1%,MgSO47H2O·为0.1%,KH2PO4为0.2%,灭菌前pH=7.

0,121℃灭菌20min,冷却至50℃以下,无菌条件下加入体积分数为10%的小牛血清。

2试验方法

2.1菌种分离筛选操作方法

(1)初筛。将牛鼻黏膜用0.1%蛋白胨溶液稀释成不同梯度涂于血琼脂平板,在37℃下培养

24h。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态,用接种针挑起看其黏度、荚膜染色和革兰氏

染色[5]并镜检。

(2)复筛。在发酵摇瓶中接入初筛疑似菌株,每株3瓶,在200r/min,37℃下培养24h。

用红外吸收光谱对经复筛发酵液提纯得到的多糖精品作定性分析。

(3)红外吸收光谱法。取HA2mg,KBr压片,用IR2400红外分光光度计在4000～

500cm-1范围内扫描。

2.2诱变方法

(1)制备菌液。菌液经3500r/min离心10min后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生

理盐水洗涤2次,重新悬浮于5mL生理盐水中,摇匀后倒入盛有45mL灭菌生理盐水并带

玻璃珠的100mL锥形瓶中,振荡10min,调整细胞浓度至108/mL。在进行诱变处理菌

体时,用0.1mol/L、pH=6.0的磷酸盐缓冲液代替生理盐水,其他与供紫外线诱变处理菌

体的菌液制备相同。

(2)紫外线诱变处理。紫外灯的功率为15W,照射距离为30cm。将3mL菌液和磁力搅拌

棒放入直径为9cm的无菌培养皿中,搅拌照射时间为2min。

(3)NTG诱变处理。称取1mgNTG倒入无菌离心管中,加入0.1mol/L、pH=6.0的

磷酸缓冲液1mL,暗处振荡溶解。取4mL菌液加入上述离心管中,充分摇匀,立即置于37℃

水浴振荡处理30min(NTG处理终浓度为100g/mL)后,离心收集菌体,将含NTG的上清