植物生物技术考试题.pdf

四,脓杆菌介导转基因的程序,并说明影响转

化效率的因素?举例说明?

原理：

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏

阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染

大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细

胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移

向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别

含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，

农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将

T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过

减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为

农杆菌介导法植物转基因的理论基础。

人们将目的基因插入到经过改造的

T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基

因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞

和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆

菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年

来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤

其是水稻）中也得到了广泛应用。

农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反

应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创

伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。

②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织

集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上

的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移

DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，

并整合到植物细胞基因组中。

方法：（根据不同受体环境基因要求而不同）

1．农杆菌准备

2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、

幼嫩茎段或叶片）;

3．用MS-AS液体培养基稀释原菌液15

倍（1.5ml/20ml）或离心后稀释3倍;

4．外植体与菌液共培养20分钟;

5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸

干多余的菌液）;

6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养

基，培养2－3天;

7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧

苄青霉素（Cb300mg/L）的固体筛选培养

基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选;

8．隔20天，进行第二次筛选；

9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化

成苗；

10在生根培养基上生根，获得完整的再分

化植株。

五,DNA分子标记的种类及优缺点?

RFLP、VNTR、RAPD、DAF、AP-PCR、

ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP、SNP、

InDel、CAPS、dCAPS、SRAP、EST

1RFLP

该技术由Grodzicker等于1974年创立特

定生物类型的基因组DNA经某一种限制性

内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同

源等位片段，或称限制性等位片段RFLP标

记技术的基本原理就是通过电泳的方法分

离和检测这些片段凡是可以引起酶解位点

变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切

位点）和一段DNA的重新组织（如插入和

缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均

可导致限制性等位片段的变化，从而产生

RFLP该技术包括以下基本步骤：DNA提

取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳

分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序

和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同

位素或非放射性物质标记的DNA作探针与

膜上的DNA杂交（称Southern杂交）；

放射性自显影或酶学检测显示出不同材料

对该探针的限制性酶切片段多态性

RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整

个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表

型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；

（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）

结果稳定可靠；（5）DNA需要量大，检测

技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中

2RAPD

由Williams等于1990年创立其基本原理与

PCR技术一致