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乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR

[目的要求]

掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理；

HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析

了解核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。

[教学时数]

讲授2学时，实验6学时。

[讲授内容]

血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计

原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应

混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作

[实验内容]

分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；

实验总结

[自学内容]

“感染性疾病的分子诊断”

实验指导（自编）

实验乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR

【原理】

RealtimePCR是普通PCR的一项改进，使用了针对扩增DNA的荧光物质，使得DNA

的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA的扩增曲线，最后通过标准曲线对

未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方

法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子

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定量的标准方法。它已逐渐代替了Northernblotting以及semiRT-PCR技术。

本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合

TaqMan荧光探针技术,利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的

TaqMan探针,实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量

试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。

TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭

基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，

DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，

报告基团释放出荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，

根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。

图4：TaqMan荧光探针技术原理

R:荧光报告基团Q：荧光淬灭基团

【试剂与器材】

1．HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、

PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，

强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子

水。

2．荧光定量PCR仪

3．PCR反应管

4．移液器及移液器吸头

5．高速离心机

6．漩涡混合器

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