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罗氏Roche公司Tunel试剂盒操作说明书

Insitucelldeathdetectionkit-POD法

一、原理：

TUNELTdT-mediateddUTPnickendlabeling细胞凋亡检测试剂盒是用

来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况..其原理

是荧光素fluorescein标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶

TdTEnzyme的作用下;可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末

端;并与连接辣根过氧化酶HRP;horse-radishperoxidase的荧光素抗体

特异性结合;后者又与HRP底物二氨基联苯胺DAB反应产生很强的

颜色反应呈深棕色;特异准确地定位正在凋亡的细胞;因而在光学显微

镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有

DNA断裂;因而没有3‘-OH形成;很少能够被染色..本试剂盒适用于

组织样本石蜡包埋、冰冻和超薄切片和细胞样本细胞涂片在单细胞水

平上的凋亡原位检测..还可应用于抗肿瘤药的药效评价;以及通过双

色法确定细胞死亡类型和分化阶段..

二、器材与试剂

器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒塑料饭盒与纱布、

塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；

试剂：试剂盒含：

1号蓝盖EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、

2号紫盖LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、

3号棕瓶Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；

自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇100、95、90、80、70%、

DAB工作液临用前配制;5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS、

ProteinaseK工作液10-20μg/mlin10mMTris/HCl;pH7.4-8或细胞通透

液0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠;临用前配制、

苏木素或甲基绿、DNase13000U/ml–

3U/mlin50mMTris-HCl;pH7.5;10mMMgCl2;1mg/mlBSA等..

三、实验步骤

操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反

应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并

拍照..

具体操作步骤石蜡包埋切片的检测：

1.用二甲苯浸洗2次;每次5min；

2.用梯度乙醇100、95、90、80、70%各浸洗1次;每次3min；

注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理

4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C温度、时间、

浓度均需摸索如果凋亡细胞染色较弱时;可用高浓度的

ProteinaseK400μg/mL处理5分钟..其它替代方法：石蜡切片的预处

理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一;即

蛋白酶K处理的步聚改用下述方法;其余步聚均相同：

替代方法1:将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10min通透液：

0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠;需新鲜配制

替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中

8-10min胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HClPH2;胰蛋白酶0.25%-0.5%溶

于0.01NHCl

替代方法3:将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml0.1M的柠檬酸缓冲

液PH6的塑料盒中;

置于微波炉中350W低档处理5min..

5.PBS漂洗2次；

6.制备TUNEL反应混合液：

处理组用50μl1号液+450μl2号液混匀；

而阴性对照组仅加50μl2号液;

阳性对照组先加入100μlDNase1;反应在15~25℃×10min;后面步骤

同处理组..

7.玻片干后;加50μlTUNEL反应混合液阴性对照组仅加50μl2号液

于标本上;加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h..

8.PBS漂洗3次；

9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞激发光波长为

450~500nm;检测波长为515~565nm；

10.玻片干后加50μl3号液converter-POD于标本上;加盖玻片或封

口膜在暗湿盒中反应37℃×30min..

11.PBS漂