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第十六章病毒病的分子生物学诊断

一、概述

二、病毒基因的克隆与鉴定

三、病毒基因探针的制备

(一)病毒基因探针的种类

(二)病毒基因探针的标记

四、核酸杂交检测技术

(一)建立杂交体系

(二)核酸打点杂交

(三)核酸酶保护分析法

(四)核酸原位杂交

五、PCR扩增技术

(一)诊断PCR技术的设计策略

(二)PCR用于DNA病毒的检测

(三)PCR用于RNA病毒的检测

(四)PCR用于分子流行病学研究

六、限制性内切酶图谱和寡核苷酸指纹图

(一)病毒基因组的限制性内切酶图谱

(二)病毒寡核苷酸指纹图(Oligonucleotidefingerprinting)

七、病毒核酸序列测定

一、概述

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗传学的进步，大大提高了

病毒病的诊断水平。病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原和抗体

的免疫学检测，进入到可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平。病毒

病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸(DNA或RNA)和蛋白质等的测定，关键在于测定这

些分子的特异序列或结构。病毒基因组往往含有特异序列，可以用核酸杂交的方法予以

检出，而这段序列的存在则说明了该病毒的存在。

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虽然病毒是严格细胞内寄生的最小、最简单的生命形式，但也具有与宿主细胞不同

的独特的核酸序列和基因结构。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电泳分析、DNA

酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)等。其中核酸杂交和

PCR技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒

病诊断中最具应用价值的方法。DNA杂交的灵敏度已经提高到0.05pg/μl水平，也就是

说，只要有1000个DNA拷贝，就可能被检测出来。使用PCR甚至可以检测出一个拷贝

的DNA分子。

分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。现已发现某些病毒与宿主细胞

或与其它病毒之间存在着同源的核酸序列，因此在建立分子杂交或PCR诊断方法时，需

要了解基因片段的核苷酸序列，获得病毒特异的片段。在这一片段上标记放射性同位素

或非放射性物质(如地高辛、生物素等)作为探针,就可建立分子杂交诊断方法;也可根据

这一片段的核苷酸序列，设计一对特异引物，应用PCR技术扩增这一片段。获得病毒特

异DNA片段的基础是进行病毒基因的克隆，即首先建立易于获得足够量病毒DNA的病毒

基因无性繁殖系。病毒基因克隆以后，就可以比较容易地用酶促法或化学法来测定其核

苷酸序列，再将获得的序列输入计算机，与基因序列库中的己知序列进行比较分析，就

能准确地定位病毒特异的基因序列。到目前为止，越来越多的病毒基因被克隆和测序，

几乎涉及所有动物病毒科的成员，一些重要病毒的全基因序列已被测定，这无疑促进了

病毒病分子生物学诊断技术的发展。

二、病毒基因的克隆与鉴定

病毒基因的克隆是在原核细胞中进行的。可以采用细菌质粒、粘性质粒或λ噬菌体

作为载体，但最常应用细菌质粒载体，在大肠杆菌(E.coli)中进行。用于基因克隆的质

粒必须具备3个主要结构特征：1.具有负责其在宿主细胞中自主复制的复制起始区

(Ori)；2.具有克隆后便于筛选的标记基因(如对各种抗生素的抗性基因等)；3.含有外源

基因的克隆位点。常用的质粒有pUC18/pUC19和pBR322等。pUC18/pUC19为高拷贝质粒

(120～200个／细胞)，含有多克隆位点，以可满足多种内切酶切割的DNA片段的克隆；

pBR322为中拷贝质粒(50～80个／细胞)。

病毒基因克隆的目的在于：1.病毒基因片段的大量制备；2.序列分析；3.基因表达

与调控研究；4.构建病毒载体；5.制备核酸探针等。病毒的基因组有DNA和RNA以及双

链和单链之分。在着手进行基因克隆前，了解目的病毒的核酸类型是必要的。对不同