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质粒dna的碱法大量制备,实验报告

大量制备质粒DNA方法

SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备

用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质

粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心

进一步纯化：

材料：

缓冲液和溶液：

碱裂解液I：

50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl（pH8.0）

10mmol/LEDTA（pH8.0）

（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭

菌15min，保存于4摄氏度。）

碱裂解液II：0.2NNaOH（从10N贮存液中现用稀释）

1%（m/V）SDS

（溶液II要现用现配，室温下使用）

碱裂解液III：5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

双蒸水（去离子水）28.5ml所配成的溶液中钾的浓度为

3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4摄氏度，用时置于冰

浴中。）

另需：

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乙醇

异丙醇

STE

TE（pH8.0）

溶菌酶（10mg/ml）

现在开始实验：

细胞的制备：

1.挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培

养基中。

注：a.试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。

b.试管不宜盖的太紧c.应在剧烈振摇下温育

2.在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期

（OD600约为0.6）。

3.在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及

适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将

此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小

时。

注：最后菌液的OD600值应为0.4。由于不同菌株的生长速度

不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。

4.若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml

浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。注：对

于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。

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5.于37摄氏度，以300r/min剧烈振荡再培养12~16h。

6.取部分菌液（1~2ml）到离心管中，4摄氏度储存。于4摄氏

度，以2700g离心15min以收集余下的近500ml培养物。弃上清，

倒置离心管使残余的上清流出。

7.用200ml冰预冷的STE重悬细菌沉淀，按步骤6所述重新收

集细菌并贮存于零下20摄氏度。

8.用步骤6中贮存的1~2ml菌液提取质粒，采用酶切和琼脂糖

电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已

得到扩增。

注：设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免

发生某些可能难以挽回、浪费大量时间的错误。

9、将步骤7中冻存的细菌在室温下放置5~10min使其解冻后，

用18ml（10ml）碱裂解液I重悬。

注：只有步骤4中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积

数。