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造血干细胞分离培养方法--第1页
造血干细胞分离培养方
法
Themanuscriptwasrevisedontheeveningof2021
造血干细胞分离培养方法--第1页
造血干细胞分离培养方法--第2页
一造血干细胞分离
（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备
1HES(羟乙基淀粉)沉淀法
抽取髓液500mL按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400g离心10min得细胞沉淀物，以1%白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2percoll液密度梯度离心法
①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1500r/min，
离心20min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨,在两头关节处切开骨骼,反复用培养基冲洗骨髓腔,随后
小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上,2000r/min离心20min。吸取
离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3Ficoll分离法
方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬
液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲
清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细
胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，
用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持
清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细
吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体
积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以
1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离
造血干细胞分离培养方法--第2页
造血干细胞分离培养方法--第3页
心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓
冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节
处切开骨骼,反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
（二）Linc--kit+造血干细胞的分离纯化。
+
去除Lin细胞(负筛选):带有生物素的混合抗体标记成熟细胞;抗生物素的
磁珠吸附抗体标记的成熟细胞,包括T,B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它
们的定向前体细胞;细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质
++
干细胞。收集CD117细胞(正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117细胞,
+
细胞通过磁场被柱子吸附的CD117细胞(具体操作步骤参照Miltenyi公司
MACS手册)。
+
（三）根据细胞表面CD34抗原进行分离纯化
流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液,加入μL
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