冷冻切片方法及注意事项.pdf

一、试验前预备

清理试验台及仪器。

开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度〔-15~-20℃*〕。

预备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。

二、取材

解剖之后快速取出所需的颖组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材〔24×24×2mm*〕,以防

形成冰晶造成切片中形成外形不一的空泡,使细胞内构造移位。

〔注：取材中目的标本既要明确也要确保其构造的完整性，应避开不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量

剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费

时，大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。〕

三、冷冻切片

1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，

至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片〔1~3分种〕。

2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

3、调好欲切的厚度，依据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，

一般在5～10μm间。

4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调

较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时

顺着一个方向略微用力轻轻一带,可避开组织摊片过程中皱折,保证组织构造的完整及切片的美观。

注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会

影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及一般胶水。B超藕合剂适用于细胞丰

富质地较嫩的组织,一般胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。〔OCT包埋剂骤冷时固化，其冷

冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。〕

②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,

组织四周再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。

③冷冻箱及冷冻头的温度凹凸，要依据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬,切片碎裂,消灭梯

田状薄厚不均或空洞;反之,温度过高,组织块硬度不够,切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。

④当切片时，假设觉察冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，

或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。由于当附贴切片时，从室温中取出的

载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质

间温度的差异，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片结实

地附贴在一起。假设使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度一样，没有发生上述的现象。

四、常用冰冻切片苏木精—伊红染色

染色步骤：1、冰冻切片用10%甲醛固定1~5分钟，流水冲洗2分钟，蒸馏水浸洗3分钟。

2、苏木精1~2分钟。自来水快洗。

3、0.5%盐酸乙醇分色1~2秒。蒸馏水快洗。

4、0.25%~0.5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗30秒~1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。

5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。

6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色比照。

7、100%乙醇2次，每次1~2分钟。

8、二甲苯2次，每次1~2分钟。中性树胶封固。

注：①完毕阶段的二甲苯作用为透亮，其目的是增加标本的折光率，到达光镜下清楚观看染色结果。标

本内假设含水分可降低其折光率，导致光镜观看微小构造不清楚的结果。另二甲苯透亮后有得于组织细

胞的长期保存。

②HE染色的水洗：整个染色过程中共5处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。

苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性〔棕红色〕

转变为弱碱性〔蓝色〕，导致“有色沉淀”消灭与积存，致使染色结果为黑蓝色。

苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染

料成分，即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。

分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液〔0.5%盐酸乙醇〕对组织细胞的分色作用。过度分色

将致使染色强度减弱，影