多巴胺的测定.pdfVIP

荧光法测定大鼠脑组织和血液中单胺类物质的方法探讨：

1、主要仪器：荧光分光光度计（日本产，SHIMADZURF-5301PC）；组织高速分散器（上海

产，XHF-1）；冷冻离心机（上海产，TGL-16G）；恒温水浴箱；旋涡混合器等。。

2、试剂：剂来源除标明外均为国产分析纯级，试剂配制使用双蒸水。

（1）标准品：重酒石酸去甲肾上腺素；盐酸多巴胺；5-羟色胺硫酸肌酐；5-羟吲哚乙酸为

瑞士Fluka产品。

（2）混合标准储存液的配制：分别精确称取上述标准品各50mg，用0.01N盐酸配制成100

ml混合标准储存液（500ug/ml），置4℃冰箱保存，临用前稀释成1.25ug/ml应用液。

（3）酸性正丁醇：每升正丁醇加入浓盐酸0.85ml，混匀。

（4）正庚烷。

（5）0.1%OPT-10N盐酸溶液：邻苯二甲醛为瑞士Fluka产品，临用前用10N盐酸稀释成

0.001%OPT-10N盐酸溶液。

（6）0.25%半胱氨酸溶液：用0.1N盐酸新鲜配制。

（7）碘试剂：配制0.02N碘液和5%碘化钠（以70%乙醇溶解），临用前以1∶1体积比混合。

（8）1/15M，PH=7.2的磷酸盐缓冲液。

（9）0.33M碳酸氢钠溶液。

（10）碱性亚硫酸钠溶液：25%亚硫酸钠与5N氢氧化钠在临用前以1∶9体积比混合。

（11）0.1MEDTA试剂：用1M醋酸钠溶液配制，以10N氢氧化钠调节pH至7.0。

3、实验方法：

⑴标本处理：大鼠断头处死，立即取血及脑组织。脑组织用冰生理盐水冲洗，去除血膜、嗅

球和小脑，沿脑中线剖开，取一半脑组织吸干水分称重，加入10倍体积的冰酸性正丁醇，

用组织分散器匀浆备用。血液静置凝固后用冷冻离心机分离血清，立即加入10倍体积冰酸

性正丁醇摇匀。

⑵提取过程：同时制备标准管和空白管，与血、脑标本在相同条件下按下图流程进行提取，

获得水相A和水相B。

⑶NE、DA的测定步骤：各管取水相A0.5ml，按下列流程进行操作：

①水相A0.5ml＋1/15M磷酸盐缓冲液1.5ml＋0.1MEDTA0.4ml＋碘液0.2ml

②混匀、静置3min＋碱性磷酸钠（新配）0.4ml

③混匀、静置3min+5N醋酸0.4ml

④混匀，80℃水浴，冷却

⑤测NE荧光测度，激发波长为382/488

⑥继续沸水浴20min，冷却

⑦测DA荧光测度，激发波长325/385。

⑷5-HT的测定步骤：各管取水相A0.4ml，按以下流程操作：

①水相A0.4ml+0.25%半胱氨酸（新配）0.1ml+0.002%OPT-10NHcl3ml

②混匀，沸水浴10min，冷却

③测各管5-HT荧光强度，激发波长为360/480。

⑸5-HIAA的测定步骤：各管取水相B0.5ml，按以下流程操作：

①水相B0.4ml+0.25%半胱氨酸（新配）0.1ml+0.002%OPT-10NHcl2.5ml

②混匀，沸水浴10min，冷却

③测各管5-HIAA荧光强度，激发波长360/480。

复合营养素对认知与运动功能损伤大鼠的干预作用及其机制研究：

脑组织单胺类神经递质—去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量的检测：

①称取一定重量的脑组织，在冰浴条件下与预冷的酸化正丁醇以1：10的比例匀浆后，

补足液体至4mL，旋涡振荡5min，以3000r／min离心5min，取上清液2.5mL置于反应管内，

加入正庚烷5.OmL，0.1mol／L盐酸5.OmL，旋涡振荡5min，以3000r／min离心5min，其

水相内含有NE、DA、5-HT。

②NE、DA含量的测定：取水相0.5mL，加入70mmol／L、pH7.2PBS1.7ml，碘试剂0.1mL，

静置2min，加入碱性亚硫酸钠溶液0.5mL，静置2min，加入6mol／L乙酸溶液0.6mL，煮沸

20min，冷水冷却，用荧光分光光度计在475nm激发光，385nm发射光处测定NE的荧光强

度；在370nm激发光，322nm发射光处测定DA的荧光强度。

③5-HT含