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腺病毒转染细胞步骤及方法

腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种线性双链DNA病毒。腺病毒不仅可以

作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达

蛋白（Massieetal.,1998a,b）。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表

明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转

移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。运用了去除5ITR、包装信号和E1

序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多

蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大

降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因

此更为安全。

二、腺病毒载体优势

1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；

2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因

转导和蛋白表达；

3)包装外源基因的片段大，高达8kb；

4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；

5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色

体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。

三、流程描述制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进

行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate进行共转染293A细胞，转

3染6小时后更换为完全培养基，培养7-15天，每3天左右补充一次新鲜培养

基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000rpm离心10分钟，

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取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，腺病毒的大量扩增，

而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液，在293A细胞中测定并标定

病毒滴度。在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

四、具体步骤

细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml

（一般稀释倍数为100倍），在0.1ml的细胞悬液中加入0.1ml的0.4%的台

盼蓝溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼

蓝，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

细胞株的冻存

1)取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-

2×107/ml。2)在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和

0.1ml二甲基亚砜（或甘油），混匀后密封。置4°C，1小时，-20°C，2小

时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

细胞复苏1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带防护眼睛和手套。2)迅速放入

盛有37°C水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。3)2000rpm，离心3分钟。4)

用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出上清液，加3ml含10%FBS的

DMEM培养基，吹打均匀，加入到6cm培养皿中，置温箱培养。5)次日更换

一次培养液后再继续培养。

细胞传代1)弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生

长面，然后弃