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细胞转染及克隆筛选--第1页

筛选之前确定G418浓度：

1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，

一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞

的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷

酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，

抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它

抗生素。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：

将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出

在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：

3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，

此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，

观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎

全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度

1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也

不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源

基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加

G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含

有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是

转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。

关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑

选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，

目的基因不一定就跟着高表达。

筛选时的培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：

1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性

死亡，因此要及时换液

2，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死

亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%

的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备

用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

3，适当增加血清浓度。

筛选时出现的问题及其解决办法：

1，问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想

把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和

周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一

起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？

a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少

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可能残