病毒感染细胞实验整体流程及原理.pdfVIP

病毒感染细胞实验整体流程及原理--第1页

成都百美科生物QQ7742053

病毒感染细胞实验整体流程及原理

目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染

细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类

病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒

1.1慢病毒

1.1.1原理

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化

学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代

瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于

感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，

并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点

1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体

内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：

1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装、-80℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、腺病毒

病毒感染细胞实验整体流程及原理--第1页

病毒感染细胞实验整体流程及原理--第2页

成都百美科生物QQ7742053

1.2.1原理

腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细

胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取

代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细

胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

1.2.2特点

1）几乎可以感染所有类型的细胞

2）可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒

3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效的进行增殖。

4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.

5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性

高。

1.2.3腺病毒包装简要流程

1）构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体

2）采用PacI消化纯化的质粒。

3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。

4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。

5）分装，-80℃保存。

1.3、慢病毒和腺病毒的比较

慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较

病毒表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus）