激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程.pdfVIP

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激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基

本结构显微镜操作规程

（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图

像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析

仪器。紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，

定量分析，以及实时定量测定等。

成像原理

接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光

点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到

由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和

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探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者

的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是

共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探

测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而

来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。

以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光

点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成

清楚的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切

面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强宏大于

非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的

景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待

察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X—Y平面（焦平面）扫描

与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过

专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。即检测针孔和

光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进

入检测针孔。

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激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传

统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，

通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。

基本结构

（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、

荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

（1）扫描模块

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扫描模块紧要由针孔光栏（掌控光学切片的厚度）、分光镜

（按波长更改光线传播方向）、发射荧光分色器（选择确定波长范

围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）构成。荧光样品中的混

合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，

被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的

共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象

及其合成图象。

（2）荧光显微镜系统

显微镜是LSCM的紧要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜

光路以无限远光学系统可便利地在其中插入光学选件而不影响