RNAi及其在抗HIV中的初步应用.ppt

主要缺点：①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）?比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框材料需求?21-merRNA

oligos(一对)29-merDNAoligos(一对)转录模版(200-1000bp，两侧带T7启动子)55-60-merDNAoligos(一对)?~50-merDNAoligos(一对)全部制备/合成时间所需时间4天—2周24小时+DNAoligo合成时间1天+转录模版制备时间5天以上+DNAoligo合成时间~6小时+DNAoligo合成时间个人所需操作时间几乎不需要*中等中等多中等是否需要验证和寻找最有效siRNA需要需要不需要需要需要能否标记能能能不能不能?比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框材料需求?21-merRNA

oligos(一对)29-merDNAoligos(一对)转录模版(200-1000bp，两侧带T7启动子)55-60-merDNAoligos(一对)?~50-merDNAoligos(一对)全部制备/合成时间所需时间4天—2周24小时+DNAoligo合成时间1天+转录模版制备时间5天以上+DNAoligo合成时间~6小时+DNAoligo合成时间个人所需操作时间几乎不需要*中等中等多中等是否需要验证和寻找最有效siRNA需要需要不需要需要需要能否标记能能能不能不能?比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框转染的相对难易程度好好好差差可筛选性(例如抗生素筛选)?不可以不可以不可以可以不可以能否用于长效抑制不可以不可以不可以可以（抗生素筛选）不可以能否大规模制备可以有限有限可以有限检测总体转染效率不可以不可以不可以可以不可以每个基因的相对费用（不包含人力）高中等低中等中等?比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框转染的相对难易程度好好好差差可筛选性(例如抗生素筛选)?不可以不可以不可以可以不可以能否用于长效抑制不可以不可以不可以可以（抗生素筛选）不可以能否大规模制备可以有限有限可以有限检测总体转染效率不可以不可以不可以可以不可以每个基因的相对费用（不包含人力）高中等低中等中等SiRNA的转染1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。miRNA的功能miRNA的主要功能很可能是进行转录后调控目前已经知道miRNA的功能多与发育的时序调控有关,但也参与了空间发育,应激性,细胞周期和基因重组等过程(McManusetal.,2019).某些miRNA与RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)相关,能导致靶mRNA的裂解,产生基因沉默miRNA的功能另外,miRNA还很可能与人类的某些疾病也有关联.在慢性淋巴细胞白血病病人中发现miR15和miR16这两个基因的表达有缺失或下调现象.这说明了miRNA很可能与人类肿瘤有关(Calinetal.,2019).最近研究还发现,miRNA还参与果蝇中的脂肪代谢(Xuetal.,2019)、在植物中控制叶和花的发育、以及在哺乳动物中造